Bu yöntem, bu hücre tiplerinde çeşitli proteinlerin alt hücresel lokalizasyonu ve dinamiği hakkında makrofaj ve dendritik hücre biyolojisi alanlarındaki anahtar soruların yanıtlatılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları nispeten basit, ucuz ve diğer mevcut yöntemlerin çoğunluğu daha iyi bir verimlilik ve ifade istikrarı göstermektedir. Prosedürü gösteren Jarmila Kralova, benim laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olacak.
Retrovirüs üretmek için, 10 santimetre petri kabında Platin Eko-ambalaj hücrelerinin tek hücreli süspansiyon plaka ve DMEM 15 mililitre hücreleri yetiştirmek, ile takviye 10%fetal sığır serum, veya FBS, kültür kadar 50-60%fluent. Ertesi gün, 20 mikrogram lık retroviral ilgi yapısı ve 10 mikrogram PCL eko-ambalaj vektörü 1 mililitre DMEM'e serumsuz, yumuşak karıştırma ile ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakikalık kuluçka için serum ve antibiyotik olmadan DMEM 1 mililitre PEI 75 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında ek bir 10 dakikalık kuluçka için birlikte her iki tüpün içeriğini karıştırın.
Daha sonra, Platin Eco hücrelerindeki ortamı %2 FBS ile desteklenen 8 mililitre taze 37 derece Santigrat DMEM ile dikkatlice değiştirin ve transfeksiyon karışımını dikkatlice tabağa ekleyin. 37 santigrat derecede 4 saatlik kuluçkadan sonra, 37 santigrat derecede 24 saatlik kuluçka için %10 FBS ile desteklenen 37 santigrat derece dmem'in 10 mililitresi ile süpernatenti değiştirin. Ertesi gün, bir ecotropic retroviral parçacık içeren supernatent bir 15 mililitre centrifuge tüp aktarmak için 5 mililitrelik pipet kullanın ve enkaz kaldırmak ve santrifüj ile hücreleri içeren.
Bu arada, 37 santigrat derece DMEM artı% 10 FBS 37 santigrat derece başka bir 24 saat kuluçka için kültür çanak 10 mililitre ekleyin ve viral parçacıkların ikinci bir tur toplamak gibi sadece gösterdi. Kemik iliği hasat için, bir doku kültürü başlık içinde, arka ekstremitederi ve kasların bir kısmını kaldırmak ve dikkatle femur bozmadan kalça ekleminden asetabulum çıkarmak için cımbız ve makas kullanın. Ayak bileği eklemlerinde pençeleri kesin ve% 70 etanol ile kemikleri sprey.
Sonra bir kağıt havlu ile kas geri kalanı çıkarın ve PBS 5 santimetre petri çanak% 2 FBS ile desteklenen kemikleri yerleştirin. Daha sonra, her kemik seti diz eklemi bükmek ve dikkatle makas ile kemikleri ayırın. Bir kemiğin her epifiz yaklaşık bir ila iki milimetre kaldırmak için makas kullanın ve bir 15 mililitre santrifüj tüpü içine kemik her iki ucundan kemik iliği floş taze PBS artı FBS ile yüklü bir 30 gauge iğne ile donatılmış bir iki veya beş mililitreşli şırınga kullanın.
Kemiklerin her birinden ilik toplandığında, kemik hücrelerini santrifüj le peletleyin ve oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca 2,5 mililitre kırmızı kan hücresi lisis tamponu ile yeniden askıya alın. Lysing sonra, yeni bir 15 mililitre santrifüj tüp içine 100 mikrometre hücresüz ile hücreleri filtre ve PBS artı FBS 12 mililitre ile muaşelik geri. DMEM pelet yeniden askıya, sayma için 10% FBS ve antibiyotikler ile takviye ve plaka beş ila 10 kez 10 bir altıncı kemik iliği hücrelerine 10 santimetre, doku dışı kültür dmem 10 mililitre de petri çanak tedavi serum ve makrofaj koloni uyarıcı faktör ile birlikte, veya MCSF.
Kültürün beşinci gününde, hücre kültürünü dikkatlice yatırın ve yaklaşık 5 mililitre orta mililitresini yemeğin kenarına yakın yüzeyden çıkarın. Sonra çanak FBS ve MCSF ile desteklenen taze 37 derece santigrat orta 20 mililitre ekleyin ve hücre kültürü kuluçka hücreleri dönmek. Hücreleri hasat etmek için, altıncı ila yedi gün, tüm orta ve yüzen hücreleri kaldırmak ve 37 derece Santigrat PBS ile kültür yıkayın.
Doku kültürü kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede 3-5 dakika boyunca %0,02 EDTA ve PBS beş mililitreile yapışık hücreleri ayırın ve ayrık hücreleri plaka nın dibinden yavaşça temizlemek için beş mililitrelik pipet kullanın. Sonra hücreleri 25 mililitre taze PBS içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre farklılaşma protokolünün başında, kemik iliği türetilmiş antijen sunan hücrelerde EGFP etiketli protein ekspresyonunu indüklemek için, kemik iliği hücrelerini dMEM artı FBS mililitre başına altıncı hücrelere 2-5 kat seyreltmek ve antibiyotikler kontenjan ve plaka iyi başına orta bir mililitre hücreleri, uygun farklılaşma sitokin ile desteklenmektedir.
Hücre kültürü kuluçka dört ila altı saat sonra, polibren ile desteklenen toplanan virüsün ilk turda iki mililitre ekleyin ve santrifüj ve hücre kültürü kuluçka dört saat kuluçka ile hücre kültürleri transduce. Transdüksiyon döneminin sonunda, her kuyudan yapışmayan hücreleri tek tek 15 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın ve hücreleri santrifüj ile toplayın. Daha büyük miktarda hücre gerekiyorsa, hücreler birden fazla kuyuda aynı constract ile enfekte olabilir ve farklılaşma dan önce havuza.
Daha sonra uygun diferansiyasyon sitokin ile desteklenen 10 mililitre kültür ortamıpeletyeniden askıya ve bir 10 santimetre olmayan doku kültürü üzerine hücreleri plaka tüp başına petri çanak tedavi, onların altı ila sekiz günlük kültür için, sadece gösterildiği gibi. Supernatent içeren ikinci virüsün toplanmasından sonra platin eko transfeksiyonun akış sitometrisi ile etkinliğinin değerlendirilmesi PSTPIP2-EGFP için ortalama transfeksiyon veriminin %62, OPAL1-EGFP için %53 olduğunu ortaya koymaktadır. Retroviral transdüksiyon, her iki kültürde de hücrelerin %90'ından fazlasında bulunan kemik iliği türemiş hücrelerinin farklılaşma durumunu etkilemez ve her iki virüsle de transdüksiyon sonrası kendi belirteçleri için pozitiflik gösterir.
Ve her iki farklı hücre tipi için de uygun, karakteristik morfolojik değişiklikler gözlenir. Not, EGFP genel ekspresyonu kemik iliği kaynaklı dendritik hücre kültürlerinde kemik iliği kaynaklı makrofaj EGFP ekspresyonu ile karşılaştırıldığında, retrovirüs türü ne olursa olsun daha düşüktü. Bu prosedürü çalışırken, olmayan doku kullanmayı hatırlamak önemlidir, kültür genellikle deney için çanak hücreleri kaldırmak için planlıyorsanız bakteri yetiştirmek için kullanılan plastik yemekler tedavi.
Bu prosedürü takiben, dendritik hücre ve makrofaj proteinlerinin alt hücresel lokalizasyonu ve dinamiği ile ilgili ek soruları cevaplamak için canlı hücre görüntüleme, süper çözünürlüklü mikroskopi veya diğer mikroskopi yöntemleri kullanılabilir. Bu teknik, makrofajlar ve dendritik hücreler tarafından ifade edilen proteinlerin dağılımını ve aralıklarını keşfetmede ve bağışıklık yanıtları sırasında bu proteinin işlevini anlamamızı ilerletmede immünoloji alanında araştırmacıların önünü açmıştır. Viral parçacıklarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve aerosol üretimini minimalize etmek, koruyucu ekipman takmak ve laminar akış başlığı kullanmak gibi önlemlerin bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınması gerektiğini unutmayın.
