Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nos campos da biologia celular macrófago e dendrítica sobre a localização subcelular e dinâmica de várias proteínas nesses tipos de células. As principais vantagens dessa técnica são que ela é relativamente simples, barata e demonstra uma melhor eficiência e estabilidade de expressão do que a maioria dos outros métodos disponíveis. Demonstrando o procedimento será Jarmila Kralova, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para produzir o retrovírus, emplaque uma suspensão unicelular de células de embalagem Eco-platina em uma placa de petri de 10 centímetros e cultivar as células em 15 mililitros de DMEM, suplementados com 10% de soro bovino fetal, ou FBS, até que a cultura seja de 50 a 60% confluente. No dia seguinte, adicione 20 microgramas da construção retroviral de interesse e 10 microgramas de vetor de embalagem ecológica PCL a 1 mililitro de DMEM sem soro, com mistura suave. Adicione 75 microliters de PEI em 1 mililitro de DMEM sem soro e antibióticos a um segundo tubo para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, e misture o conteúdo de ambos os tubos para uma incubação adicional de 10 minutos à temperatura ambiente.
Em seguida, substitua cuidadosamente o meio nas células Platinum Eco por 8 mililitros de DMEM frescos de 37 graus Celsius suplementados com 2%FBS e adicione cuidadosamente a mistura de transfecção em gotas à placa. Após uma incubação de 4 horas a 37 graus Celsius, substitua o supernatent por 10 mililitros de 37 graus Celsius DMEM, complementado com 10% de FBS para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, use uma pipeta de 5 mililitros para transferir o supernênatário retronacírico ecotrópico contendo partículas para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e remover os detritos e conter células por centrifugação.
Enquanto isso, adicione 10 mililitros de 37 graus Celsius DMEM mais 10% FBS ao prato de cultura para outra incubação de 24 horas a 37 graus Celsius e colete uma segunda rodada de partículas virais como acabou de demonstrar. Para colher a medula óssea, em uma capa de cultura de tecido, use pinças e tesouras para remover a pele e parte dos músculos dos membros posteriores e desalojar cuidadosamente o acetábulo da articulação do quadril sem quebrar o fêmur. Corte as patas nas articulações do tornozelo e pulverize os ossos com 70% de etanol.
Em seguida, remova o resto do músculo com uma toalha de papel e coloque os ossos em uma placa de petri de 5 centímetros de PBS complementada com 2%FBS. Em seguida, dobre a articulação do joelho de cada conjunto ósseo e separe cuidadosamente os ossos com uma tesoura. Use a tesoura para remover cerca de um a dois milímetros de cada epífise de um osso e use uma seringa de dois ou cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 30 carregada com PBS fresco mais FBS para lavar a medula óssea de ambas as extremidades do osso em um tubo de centrífugas de 15 mililitros.
Quando a medula tiver sido coletada de cada um dos ossos, pelota as células ósseas por centrifugação e suspenda novamente a pelota em 2,5 mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos por dois a três minutos à temperatura ambiente. Após a lise, filtre as células através de um coador de células de 100 micrômetros em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros e restaure a tenacidade com 12 mililitros de PBS mais FBS. Suspenda novamente a pelota em DMEM, suplementada com 10% de FBS e antibióticos para contagem e placa de cinco a dez vezes 10 vezes 10 para a sexta células de medula óssea em uma placa de petri tratada de cultura não tecidual de 10 centímetros em 10 mililitros de DMEM complementados com fator estimulante de colônias de soro e macrofago, ou MCSF.
No quinto dia de cultura, incline cuidadosamente o prato de cultura celular e remova todos, exceto aproximadamente 5 mililitros de meio da superfície perto da borda do prato. Em seguida, adicione 20 mililitros de meio fresco de 37 graus Celsius suplementados com FBS e MCSF ao prato e devolva as células à incubadora de cultura celular. Para colher as células, no sexto ao sétimo dia, remova todas as células médias e flutuantes e lave a cultura com PBS de 37 graus Celsius.
Retire as células aderentes com cinco mililitros de 0,02% EDTA e PBS por três a cinco minutos a 37 graus Celsius na incubadora de cultura tecidual e use uma pipeta de cinco mililitros para lavar suavemente as células dissociadas do fundo da placa. Em seguida, transfira as células para um tubo centrífuga de 50 mililitros contendo 25 mililitros de PBS fresco. Para induzir a expressão proteica marcada pela EGFP em células de presente de medula óssea, no início do protocolo de diferenciação celular, diluir as células de medula óssea a uma de dois a cinco vezes 10 para as sextas células por mililitros de DMEM mais FBS e antibióticos conentrção e placa das células de um mililitro de médio por poço, complementados com a diferenciação apropriada citocina.
Após quatro a seis horas na incubadora de cultura celular, adicione dois mililitros da primeira rodada de vírus coletados complementados com polibreno e transduza as culturas celulares por centrifugação e uma incubação de quatro horas na incubadora de cultura celular. Ao final do período de transdução, transfira as células nãoadherentes de cada poço para tubos individuais de centrífugas de 15 mililitros e colete as células por centrifugação. Se for necessária uma maior quantidade de células, as células podem ser infectadas com o mesmo constrato em vários poços e agrupadas antes da diferenciação.
Em seguida, suspenda novamente as pelotas em 10 mililitros de cultura de meio suplementado com a diferenciação adequada citocina e emplaque as células em uma placa de petri tratada por tubo de 10 centímetros, para sua cultura de seis a oito dias, como apenas demonstrado. A avaliação da eficácia da transfecção Platinum Eco por citometria de fluxo após a coleta do segundo vírus contendo supernêgente revela uma eficiência média de transfecção de 62% para PSTPIP2-EGFP e 53% para OPAL1-EGFP. A transdução retroviral não afeta o status de diferenciação das células derivadas da medula óssea com mais de 90% das células em ambas as culturas demonstrando positividade para seus respectivos marcadores após a transdução com qualquer vírus.
E com as mudanças morfológicas apropriadas e características observadas para ambos os tipos de células diferenciadas. Note-se que a expressão geral do EGFP foi menor nas culturas de células dendríticas derivadas da medula óssea em comparação com a expressão do macrófago derivado da medula óssea EGFP, independentemente do tipo de retrovírus. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar pratos plásticos não tecidos, cultura tratada que são tipicamente usados para cultivar bactérias se você planeja remover células do prato para experimentar.
Após esse procedimento, outros métodos de imagem celular viva, microscopia de super resolução ou outros tipos de microscopia podem ser empregados para responder a perguntas adicionais sobre a localização subcelular e dinâmica de células dendríticas e proteínas macrófagos de interesse. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da imunologia na exploração da distribuição e relações espaçais de proteínas expressas por macrófagos e células dendríticas e em promover nossa compreensão da função dessas proteínas durante as respostas imunológicas. Não se esqueça que trabalhar com partículas virais pode ser extremamente perigoso e que precauções, como a geração mínima de aerossol, o uso de equipamentos de proteção e o uso de uma capa de fluxo laminar, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
