Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della macrofagia e della biologia delle cellule dendritiche sulla localizzazione subcellulare e la dinamica di varie proteine in questi tipi di cellule. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è relativamente semplice, economica e dimostra una migliore efficienza e stabilità di espressione rispetto alla maggior parte degli altri metodi disponibili. A dimostrare la procedura sarà Jarmila Kralova, studentessa del mio laboratorio.
Per produrre il retrovirus, placcare una sospensione uni celle di Platinum Eco-packaging in una piastra di petri di 10 centimetri e coltivare le cellule in 15 millilitri di DMEM, integrati con siero bovino fetale al 10%, o FBS, fino a quando la coltura è dal 50 al 60% confluente. Il giorno dopo, aggiungere 20 microgrammi del costrutto retrovirale di interesse e 10 microgrammi di vettore di eco-packaging PCL a 1 millilitro di DMEM senza siero, con miscelazione delicata. Aggiungere 75 microlitri di PEI in 1 millilitro di DMEM senza siero e antibiotici a un secondo tubo per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente e mescolare il contenuto di entrambi i tubi per un'ulteriore incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, sostituire con cura il mezzo sulle celle Platinum Eco con 8 millilitri di DMEM fresco di 37 gradi Celsius integrato con 2%FBS e aggiungere con cura la miscela di trasfezione in gocce alla piastra. Dopo un'incubazione di 4 ore a 37 gradi Celsius, sostituire il supernatente con 10 millilitri di 37 gradi Celsius DMEM, integrato con 10%FBS per un'incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, utilizzare una pipetta da 5 millilitri per trasferire il supernatente contenente particelle retrovirali ecotropiche in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e rimuovere i detriti e contenenti cellule mediante centrifugazione.
Nel frattempo, aggiungi 10 millilitri di 37 gradi Celsius DMEM più 10% FBS al piatto di coltura per un'altra incubazione di 24 ore a 37 gradi Celsius e raccogli un secondo ciclo di particelle virali come appena dimostrato. Per raccogliere il midollo osseo, in un cappuccio di coltura tissutale, utilizzare pinzette e forbici per rimuovere la pelle e parte dei muscoli dagli arti posteriori e rimuovere con cura l'acetabulo dall'articolazione dell'anca senza rompere il femore. Tagliare le zampe alle articolazioni della caviglia e spruzzare le ossa con il 70% di etanolo.
Quindi rimuovere il resto del muscolo con un tovagliolo di carta e posizionare le ossa in una piastra di petri di 5 centimetri di PBS integrata con 2%FBS. Quindi, piegare l'articolazione del ginocchio di ogni set osseo e separare accuratamente le ossa con le forbici. Utilizzare le forbici per rimuovere circa uno o due millimetri di ogni epifisi di un osso e utilizzare una siringa da due o cinque millilitri dotata di un ago calibro 30 caricato con PBS fresco più FBS per sciacquare il midollo osseo da entrambe le estremità dell'osso in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Quando il midollo è stato raccolto da ciascuna delle ossa, pellettare le cellule ossee mediante centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in 2,5 millilitri di tampone dilisi dei globuli rossi per due o tre minuti a temperatura ambiente. Dopo il lysing, filtrare le celle attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri in un nuovo tubo di centrifuga da 15 millilitri e ripristinare la tenacia con 12 millilitri di PBS più FBS. Sospendere nuovamente il pellet in DMEM, integrato con 10%FBS e antibiotici per il conteggio e piastra da cinque a 10 volte 10 alla sesta cellule del midollo osseo in una piastra di Petri trattata con coltura non tissutale di 10 centimetri in 10 millilitri di DMEM integrata con fattore stimolante della colonia di siero e macrofagi, o MCSF.
Il quinto giorno di coltura, inclinare con cura il piatto di coltura cellulare e rimuovere tutti tranne circa 5 millilitri di mezzo dalla superficie vicino al bordo del piatto. Quindi aggiungere 20 millilitri di mezzo fresco di 37 gradi Celsius integrato con FBS e MCSF al piatto e restituire le cellule all'incubatore di coltura cellulare. Per raccogliere le cellule, dal sesto al settimo giorno, rimuovere tutte le cellule medie e galleggianti e lavare la coltura con PBS a 37 gradi Celsius.
Staccare le cellule aderenti con cinque millilitri dello 0,02%EDTA e PBS per tre o cinque minuti a 37 gradi Celsius nell'incubatore di coltura tissutale e utilizzare una pipetta da cinque millilitri per sciacquare delicatamente le cellule dissociate dal fondo della piastra. Quindi trasferire le cellule in un tubo di centrifuga da 50 millilitri contenente 25 millilitri di PBS fresco. Per indurre l'espressione proteica taggata EGFP nell'antigene derivato dal midollo osseo che presenta le cellule, all'inizio del protocollo di differenziazione cellulare, diluire le cellule del midollo osseo a due o cinque volte 10 alla sesta cella per millilitri di DMEM più FBS e antibiotici conentration e placcare le cellule di un millilitro di mezzo per pozzo, integrato con l'appropriata differenziazione citochina.
Dopo quattro o sei ore nell'incubatrice di coltura cellulare, aggiungere due millilitri del primo ciclo di virus raccolti integrati con polibrene e trasdurre le colture cellulari mediante centrifugazione e un'incubazione di quattro ore nell'incubatore di coltura cellulare. Al termine del periodo di trasduzione, trasferire le cellule non arent da ciascun pozzo in singoli tubi di centrifuga da 15 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Se è necessaria una maggiore quantità di cellule, le cellule possono essere infettate con lo stesso contatto in più pozzi e raggruppate prima della differenziazione.
Quindi sospendere nuovamente i pellet in 10 millilitri di mezzo di coltura integrati con l'appropriata citochina di differenziazione e placcare le cellule su una piastra di petri trattata con coltura non tissutale di 10 centimetri per tubo, per la loro coltura di sei-otto giorni, come appena dimostrato. La valutazione dell'efficacia della trasfezione Platinum Eco per citometria del flusso dopo la raccolta del secondo virus contenente supernatent rivela un'efficienza di trasfezione media del 62% per PSTPIP2-EGFP e del 53% per OPAL1-EGFP. La trasduzione retrovirale non influisce sullo stato di differenziazione delle cellule derivate dal midollo osseo con oltre il 90% delle cellule in entrambe le colture che dimostrano positività per i rispettivi marcatori dopo la trasduzione con entrambi i virus.
E con i cambiamenti morfologici appropriati e caratteristici osservati per entrambi i tipi di cellule differenziate. Da notare che l'espressione complessiva di EGFP era inferiore nelle colture cellulari dendritiche derivate dal midollo osseo rispetto all'espressione EGFP del macrofago derivato dal midollo osseo, indipendentemente dal tipo di retrovirus. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare piatti di plastica non tessuti trattati in coltura che vengono in genere utilizzati per coltivare batteri se si prevede di rimuovere le cellule dal piatto per l'esperimento.
Seguendo questa procedura, altri metodi di imaging a cellule vive, microscopia a super risoluzione o altri tipi di microscopia possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande sulla localizzazione subcellulare e sulla dinamica delle proteine delle cellule dendritiche e dei macrofagi di interesse. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia nell'esplorare la distribuzione e le relazioni spaziali delle proteine espresse da macrofagi e cellule dendritiche e nel promuovere la nostra comprensione della funzione di queste proteine durante le risposte immunitarie. Non dimenticare che lavorare con particelle virali può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come la minimizzazione della generazione di aerosol, l'uso di dispositivi di protezione e l'uso di una cappa di flusso laminare, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
