Este método permite la visualización en tiempo real de diferentes eventos, que tienen lugar en la médula ósea del cráneo del ratón, como los megacariocitos, extendiendo los proplatatos dentro de los vasos sinusoides. La principal ventaja de esta técnica es una cirugía menor necesaria minimizando la reacción inflamatoria, permitiendo una visualización in vivo de los eventos en las condiciones casi de fábrica. Para comenzar, transporte el ratón a la sala de imágenes.
Encienda el microscopio y la computadora y configure los parámetros requeridos. Una vez que el ratón haya anestesiado por completo, coloque el ratón en un plato caliente, calentado a 37 grados centígrados para todas las manipulaciones posteriores, afeite la cabeza y la garganta del ratón y aplique el gel en los ojos para evitar la sequedad. Coloque el ratón sobre su espalda y fije las patas anteriores con cinta quirúrgica para estirar la garganta.
Después de desinfectar la garganta, haga una incisión de 0,7 a 1 centímetro sobre la vena yugular derecha o izquierda con tijeras y estire el tejido conectivo adyacente para exponer la vena malabarista externa en la parte superior del músculo pectoral. Llene el catéter con solución salina fisiológica tibia y estéril. Penetre el catéter a través del músculo pectoral y luego inserte el catéter en la vena.
Retire suavemente la aguja, conecte la jeringa con los trazadores fluorescentes e inyecte el volumen muerto del catéter. Coloque una gota de pegamento quirúrgico para estabilizar el catéter. Devuelva con cuidado el ratón a una posición prona.
Desinfecte el cuero cabelludo con etanol al 70% con una toalla de papel mientras elimina el vello suelto. Use tijeras y pinzas finas estériles para hacer una incisión en forma de T en la línea media hasta un centímetro entre las orejas en el cuero cabelludo para exponer el calvario. Exponga el cráneo con pinzas, luego use tijeras y pinzas para quitar cuidadosamente el periostio.
Use un hisopo de algodón estéril empapado y solución salina fisiológica para eliminar todo el periostio y cualquier residuo o cabello que pueda alterar la imagen. Enjuague el cráneo con solución salina para eliminar cualquier rastro de sangre y seque rápidamente el hueso con un hisopo de algodón. Aplique el gel de pegamento al anillo, coloque el anillo sobre el hueso expuesto y manténgalo durante unos segundos para permitir que el anillo se adhiera firmemente al cráneo.
Humedezca ligeramente el cráneo con un hisopo de algodón con solución salina. Prepare la pasta dental de silicio mezclando cuidadosamente los componentes azul y amarillo en una proporción de uno a uno. Selle el anillo aplicando la pasta dental para evitar fugas durante las imágenes.
Retire con cuidado cualquier pasta dental o pegamento que pueda haber entrado en el anillo. Luego llene el anillo con solución salina para verificar la fuga. Coloque el ratón en el soporte y coloque una compresa doblada debajo de la cabeza del animal para levantar la cabeza y evitar el desprendimiento del anillo del cráneo cuando se une al soporte.
Atornille el anillo en el soporte del bloque. Coloque el soporte y el conjunto del ratón en la cámara del microscopio calentada. Establezca las longitudes de onda láser apropiadas para los cuatro cuatro elegidos y recupere las luces emitidas.
Utilizando el catéter inter malabarista inyectar 50 microlitros de solución micromolar 0,2 del trazador fluorescente para etiquetar la vasculatura. Coloque la etapa del microscopio con el soporte y el mouse debajo del objetivo del microscopio. Asegúrese de que el anillo esté siempre lleno de solución salina y vuelva a llenarlo si es necesario, y sumerja el objetivo y la solución salina.
Use la epifluorescencia para localizar los vasos de la médula ósea y observar los megacariocitos alineados a lo largo de los vasos sinusoides. Para adquisiciones largas, configure una adquisición espacio-temporal en 3D con una imagen de 384 por 384 píxeles utilizando un escáner de resonancia de ocho kilos de Hertz y un modo bidireccional. Use el promedio de línea con buena resolución, luego elija el tamaño de paso Z optimizado y configure el intervalo de tiempo necesario antes de comenzar la adquisición.
Para adquisiciones cortas y rápidas, elija un tipo de adquisición de espacio, tiempo y minimice el tamaño de la imagen. Si es necesario, ajuste la imagen al vaso girando el campo de imágenes. Utilice la velocidad de escaneo y el escaneo bidireccional más altos disponibles.
Minimice el promedio de línea para encontrar el compromiso óptimo entre la definición de la imagen y la rapidez de la adquisición. Adquiera solo un plan Z y minimice el intervalo de tiempo para la adquisición. Para medir la velocidad plaquetaria, de 10 a 20 segundos de adquisición deben ser suficientes.
El marcador fluorescente se administró por vía intravenosa para obtener imágenes de los vasos sinusoides de la médula anastomosada en la médula ósea del cráneo, con la dirección del flujo representada por la flecha. Se registró la velocidad plaquetaria fluorescente en cada rama del vaso y se observó variación. Los vasos sinusoides presentan flujos complejos debido a las anastomosis, con presencia de reflujo de flujo e incluso estasis.
Las flechas indicaban la dirección opuesta del flujo en la bifurcación. También se midió la velocidad plaquetaria para las ramas de los vasos izquierdo y derecho indicó irregularidad a lo largo del tiempo en cada rama del vaso con fases de aceleración, estasis y desaceleración. Se observaron diferentes morfologías de proplatelets, incluyendo proplatelets con márgenes irregulares, luego proplatelets largos y proplatelets gruesos y cortos.
Cuando los megacariocitos extendieron los proplatlets en las áreas de flujos complejos, los proplalets se volcaron de una rama del vaso a la otra, de acuerdo con la dirección del flujo. Al detener el flujo sanguíneo, los proplatlets se relajaron y el ratón inesperadamente sufrió un paro cardíaco, lo que indica la importancia de las fuerzas hidrodinámicas en el alargamiento del proplatelet. También se midió el ancho y la longitud de los proplatlets de 5,2 micrómetros y se observó una longitud máxima media de aproximadamente 185 micrómetros.
Trazar la longitud del proplatelet en función del tiempo permite la visualización del comportamiento de los proplatelets durante las fases de elongación, estasis o incluso retracción. Se observó la velocidad media de elongación de aproximadamente 10 micrómetros por minuto. La instalación del catéter, permitió la inyección de fármacos para estudiar los efectos sobre la formación de proplatlet u otros eventos de interés en tiempo real.
