La replicación viral del VHB en la extrahepática desempeña un papel importante en la patogénesis de los síndromes extrahepáticos. Actualmente, los modelos de cultivo celular para iniciar la infección extrahepática por EL VHB son limitados. Presentamos un modelo de infección in vitro no hepática para ayudar a identificar nuevos factores del huésped que afectan la replicación del VHB e investigar enfermedades renales relacionadas con el VHB.
En comparación con los modelos tradicionales de infección por VHB, adoptamos y diseñamos la línea celular 293T, 293T-NE-3NR, y la co-cultivamos con HepG2.2.15. La infección por VHB debe realizarse en un laboratorio de nivel de bioseguridad dos o de nivel tres de bioseguridad. Se deben seguir las prácticas de seguridad de laboratorio para garantizar la seguridad del personal de laboratorio y todos los investigadores deben vacunarse y detectar anticuerpos HBS positivos antes de realizar experimentos con el VHB.
Comience por cultivar las células HepG2.2.15 teniendo en cuenta que el sobrenadante celular, así como todas las puntas, matraces, placas y tubos que entran en contacto con HepG2.2.15 deben empaparse en un 2% de virucida durante la noche antes de su eliminación. Retire el vial que contiene las células HepG2.2.15 del nitrógeno líquido y descongelarlo en un suave remolino en un baño de agua Celsius de 37 grados. Transfiera las células a un matraz de cultivo de tejido cuadrado de 25 centímetros y agregue cuatro mililitros de medio de cultivo completo.
Cultivo de las células HepG2.2.15 a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono en una incubadora humidificada. Cambie el medio cada tres días. Cuando esté listo, recoja el sobrenadante de la célula en un tubo centrífugo de 50 mililitros.
Cierre la tapa firmemente y envuélvala con película de parafina. Para eliminar los fragmentos celulares, filtre el sobrenadante HepG2.2.15 con una membrana de 0,45 micrómetros en un nuevo tubo centrífugo de 50 mililitros. A continuación, agregue 14 mililitros de sobrenadante filtrado a una columna del concentrador de virus y cierre la tapa.
Centrifugar la columna a 3.200 veces g durante 35 minutos en una centrífuga giratoria horizontal y recoger el concentrado de sobrenadante HepG2.2.15 en un tubo de 1,5 mililitros. Ejecute la PCR en tiempo real para asegurarse de que la concentración si el ADN del VHB en el concentrado de sobrenadante HepG2.2.15 está dentro del rango de curva estándar. Diluir el concentrado 20 veces añadiendo 10 microlitros a 190 microlitros de DMEM en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Junto con el concentrado de sobrenadante, preparar un control negativo, control positivo, y cuatro diluciones de la referencia cuantitativa. Añadir 450 microlitros de tampón de extracción de ADN HBV a cada muestra y centrifugarlos a 12.000 veces g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Combine 27 microlitros de mezcla maestra de PCR y tres microlitros de enzima Taq polimerasa por muestra en tubos pcR colocados sobre hielo.
A continuación, agregue 20 microlitros de la muestra centrifugada a cada tubo. Realice PCR en tiempo real de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y exporte los valores de TC para obtener una curva estándar. Divida el concentrado de sobrenadante HepG2.2.15 en alícuotas y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta que esté listo para usar.
Preparar el medio de infección de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Luego sembrado HepG2-NE en dos pozos, 293T-NE-3NR células en dos pozos, y 293T-NE en un pozo. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada durante 24 horas.
Después de la incubación, observa las células y procede con la infección si están sanas. Añadir 500 microlitros del complejo de infección a cada pozo e incubar las células durante otras 24 horas. Lave las células dos veces con 500 microlitros de PBS.
A continuación, agregue un mililitro de medio a cada pozo. Cambie el medio suavemente cada dos días. El día 11, lave suavemente las células dos veces con 500 microlitros de PBS y fije las células con metanol frío en frío para la inmunofluorescencia.
Siembra 100.000 células por pozo de HepG-NE en dos pozos, 293T-NE-3NR en dos pozos, y 293T-NE en un pozo de la placa. Semilla 100.000 células por pozo de HepG2.2.15 en cinco inserciones de membrana en una placa separada de seis pozos. Incubar las células durante 24 horas.
Después de la incubación, asegúrese de que todas las células son adherentes y en buen estado. Deseche el medio en la placa de seis pozos y las inserciones de membrana celular. A continuación, coloque los insertos de membrana con HepG2.2.15 en la placa de seis pozos sembrada con HepG-NE, 293T-NE-3NRs y 293T-NE.
Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada, cambiando el medio cada tres a cuatro días. Después de 10 días, retire los insertos de membrana, lave suavemente las células con PBS dos veces y fije las células con metanol frío hielo para la inmunofluorescencia. La incubación con el anticuerpo primario HBcAg y DAPI dio lugar a una tinción distinta cuando se observó con un objetivo 10X en un microscopio invertido fluorescente.
La localización nuclear se confirmó mediante tinción con expresión DAPI y NTCP-EGFP se identificó con fluorescencia verde. Los sitios de expresión de HBcAg se localizaron con fluorescencia roja. Cuando DAPI, NTCP y HBcAg están en la misma célula, la célula se ha infectado con éxito con el VHB.
El grupo Cyclosporin A era el control negativo porque evita que el VHB entrara en las células bloqueando el NTCP. HBcAg se detectó en 293T-NE-3NR, pero no en células 293T-NE que indican que el NTCP no es el único factor esencial para la infección por VHB en 293T. Buen estado celular y operación eficiente son los puntos clave para obtener resultados de infección exitosa.
Lavar y cambiar suavemente los medios después de la infección también es importante. Como alternativa, el método de infección por VHB con células HepG2-NE basadas en hepatoma tiene una mayor eficiencia de infección que este método y es adecuado para la detección de fármacos anti-VHB. Modelar la infección por EL VHB en 293T-NE-3NR es un complemento útil al modelo celular tradicional debido al fondo no hepático de estas células.
Este método facilitará el estudio de la infección por VHB en células no hepáticas, así como los factores host necesarios para el hígado del VHB.
