Este método puede ayudar a responder preguntas clave en infecciones hepatotrópicas y campos de enfermedad hepática. Como la contribución de las poblaciones de células residentes en el hígado, a la patogénesis viral, la cinética de infecciones longitudinales, los mecanismos de replicación viral, la invasión inmune, en un sistema de modelos fisiológicos y estudios de pruebas de fármacos. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de recapitular un microambiente hepático.
Que se puede mantener durante largos períodos de tiempo y es naturalmente susceptible a la infección por hepatitis B a niveles fisiológicos relevantes. Esto ha sido anteriormente una restricción fundamental en el campo de la hepatitis B. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia o el diagnóstico de la infección por VHB porque los estudios de pruebas de drogas se pueden realizar en una plataforma fisiológica para largas duraciones.
Esto permite la evaluación de tratamientos farmacológicos secuenciales junto con el análisis de la eficacia de las estrategias de tratamiento existentes y novedosas. Este método puede proporcionar comprensión en la hepatitis B, y también se puede aplicar a otros estudios de la enfermedad, incluyendo otras infecciones hepatotrópicas, enfermedades hepáticas, o estudios de metabolismo de drogas. Generalmente, individuos nuevos en este método lucharán, porque requiere atención a detalles particulares para permitir el mantenimiento exitoso del tejido hepático durante largos períodos de tiempo.
Y también la familiarización con las herramientas y equipos especializados. La demostración visual de este método es fundamental. Incluyendo el montaje de las placas, así como la descongelación y la siembra de las células.
Dado que los pasos involucrados en el cultivo a largo plazo de las células derivadas del hígado son difíciles cuando se utiliza un nuevo sistema de cultivo. En primer lugar, encienda el compresor y la bomba de vacío asociada con la plataforma de chip hepático. Proceda a un gabinete de tubo de vidrio para ensamblar y equilibrar las placas.
Coloque una membrana estéril en la base de la placa para comenzar a ensamblar asépticamente las placas microfluídicas. Asegurarse de que la membrana estéril descansa suavemente sobre los dos pines de la placa base. A continuación, agregue la placa superior que contiene bien.
Agregue una tapa de placa estéril. Y utilice un par de precisión automatizado, establecido en 33 libras. Usando una secuencia de apriete en espiral para apretar los tornillos en la base de la placa.
Usando un par manual, asegúrese de que todos los tornillos estén apretados a 35 libras. A continuación, precalentar la siembra de hepatocitos de media a 37 grados celsius antes del cebado. Coloque la placa completamente montada en el muelle de lavado.
Y asegúrese de que la placa encaje completamente. Añadir 400 microlitros de medio de siembra de hepatocitos al lado del depósito de cada pozo para preparar la placa. Después de esto, inicie el flujo en la dirección ascendente durante 3,5 minutos a un microlitro por segundo.
Los indicadores rojos en el lado de la placa indicarán si la circulación microfluídica funciona correctamente. Una vez que el medio se bombea al lado de crecimiento celular de la placa, añadir 1,2 mililitros adicionales de medio de siembra de hepatocitos. Transfiera cuidadosamente la placa a la estación de acoplamiento dentro de una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% co2.
Inicie el flujo en la dirección ascendente a un caudal de un microlitro por segundo durante 16 horas. Después de esto, transfiera el plato a un muelle de lavado. Pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para eliminar cualquier burbuja.
Usando un fórceps estéril, agregue un papel de filtro redondo estéril a cada podé. A continuación, agregue un andamio de unión a la celda y un anillo de retención a cada pozo. Utilice un émbolo estéril para empujar hacia abajo cada pozo y bloquear los anillos de retención y andamios en su lugar.
A continuación, aspirar todo el medio. Y agregue suavemente 400 microlitros de medios de siembra de hepatocitos precalentados sobre el andamio. Inicie el flujo en una dirección descendente a un microlitro por segundo durante 3 minutos y medio.
Aspirar todo el medio bombeado fuera del lado del depósito de la placa. Añadir 1,4 mililitros de medio de siembra de hepatocitos a cada pozo. A continuación, vuelva a colocar la placa en el muelle para llevar el volumen total por pozo hasta 1,6 mililitros.
En primer lugar, precalentar el medio de descongelación de hepatocitos y la siembra de hepatocitos de media a 37 grados centígrados. A continuación, descongelar un vial de hepatocitos humanos primarios de acuerdo con las instrucciones del proveedor. En un armario de tubo de vidrio, resuspender las células en un mililitro de medio de siembra de hepatocitos.
A continuación, coloque las células resuspendidas sobre hielo. Usando el azul de tripano, cuente las células para asegurarse de que la viabilidad de las células está por encima del 90% Transfiera la placa completamente montada al muelle de lavado. Y aspirar todo el medio de los pozos.
Recupera las células del hielo y añade 600.000 hepatocitos a cada pozo en un volumen de 500 microlitros de medio de siembra de hepatocitos. Inicie el flujo en la dirección descendente a un caudal de un microlitro por segundo. Añadir 900 microlitros de medio de siembra de hepatocitos a cada pozo para llevar el volumen total en cada uno a 1,6 mililitros.
Transfiera la placa a la estación de acoplamiento dentro de una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y con un 5% de CO2. Inicie el flujo en la dirección descendente a un caudal de un microlitro por segundo durante ocho horas. Después de esto, invierta el flujo hacia arriba a un caudal de un microlitro por segundo durante ocho horas.
A continuación, transfiera la placa al muelle de lavado y aspire todo el medio de los pozos. Añadir 400 microlitros de medio de mantenimiento de hepatocitos a cada pozo. E inicie el flujo en la dirección descendente a un caudal de un microlitro por segundo durante 3 minutos y medio.
A continuación, aspirar todo el medio del depósito, y añadir 1,4 mililitros de medio de mantenimiento de hepatocitos. Transfiera la placa a la estación de acoplamiento dentro de una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% co2. Inicie el flujo en la dirección ascendente a un caudal de un microlitro por segundo durante 48 horas.
Después de 48 horas, lave el plato transfiriéndolo al muelle de lavado. Aspirar todo el medio de los pozos. Y añadir 400 microlitros de medio de mantenimiento.
E inicie el flujo en la dirección descendente en un microlitro por segundo durante 3,5 minutos. A continuación, aspirar todo el medio que aparece en el lado del depósito de los pozos. Añadir 1,4 mililitros de medio de mantenimiento de hepatocitos.
A continuación, transfiera la placa de vuelta a la estación de acoplamiento de la incubadora humidificada. Inicie el flujo en la dirección ascendente a un caudal de un microlitro por segundo durante 48 horas. Sustituya el medio con este proceso de lavado y reemplazo cada 48 horas.
Los hepatocitos humanos primarios generalmente sólo son estables durante una cantidad limitada de tiempo cuando se utilizan sistemas de cultivo convencionales. Sin embargo, utilizando el protocolo descrito aquí, se pueden mantener funcionalmente durante períodos de tiempo prolongados. La albúmina humana es secretada por hepatocitos funcionales, y se considera que es el mejor marcador para evaluar la funcionalidad hepática.
La albúmina es vista estable y muy expresada por las culturas 3D hasta al menos el día 40 después de la siembra. Para los co-cultivos, la funcionalidad y la viabilidad de las células de Kupffer se evalúan midiendo la secreción de citoquinas específicas. Como se ve aquí, los niveles medidos de ALFA IL-6 y TNF indican que las células fueron funcionalmente mantenidas y viables.
Además de conservar su metabolismo celular fisiológico, estos cultivos se volvieron excepcionalmente susceptibles a la infección por el VHB. El ADN del VHB y otros marcadores virales son fácilmente detectables desde el segundo día después de la infección. Mientras que los cultivos convencionales requieren inoculación con al menos 500 equivalentes del genoma del VHB complementados con DMSO y PEG, estos cultivos 3D están infectados con tan poco como 05 equivalentes del genoma sinabastecimiento.
Además de los marcadores secretos de infección viral, los andamios que contienen hepatocitos se recuperan de estos cultivos. La microscopía de inmunofluorescencia revela que estos andamios contienen antígenos virales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar ser suave al manipular los hepatocitos antes de la siembra para evitar la muerte celular.
Además, es esencial asegurarse de que las placas están correctamente montadas y todos los canales de flujo están permitiendo la correcta circulación de medios antes de sembrar los hepatocitos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunofluorescencia para responder preguntas adicionales. Incluyendo la ubicación y frecuencia de las células infectadas dentro del tejido.
El estado fisiológico de los hepatocitos también se puede evaluar mediante la tinción de albúmina o estructuras hepáticas, incluida la proteína de unión estrecha ZO-1. Después de este desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la virología exploren la infección por hepatitis B y las respuestas inmunitarias en un sistema modelo 3D fisiológico. No olvide que trabajar con el virus de la hepatitis B puede ser peligroso, y las precauciones como la vacunación previa, el uso de EPI adecuado y el trabajo bajo las pautas adecuadas de bioseguridad siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
