Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología molecular y las esferas genéticas de Hymenoptera, como los sistemas de determinación sexual. La principal ventaja de esta técnica es que podemos inducir fácilmente líneas de endogamia sobre la hormiga Vollenhovia Emery, que son esenciales para la cartografía genética y el estado molecular. Por lo tanto, esta misión puede proporcionar una visión del sistema de determinación sexual de una hormiga específica y también se puede aplicar a otras hormigas y otras especies de hymenopteras, como las avispas.
Para comenzar el protocolo, recoja las colonias V.Emeryi a principios del verano. Transfiera los especímenes de hormiga de las ramas recolectadas a un nido de yeso artificial con una cubierta de vidrio, utilizando un aspirador. Mantener las colonias en el nido artificial a 25 grados C, bajo un ciclo de luz-oscuridad de 16 a ocho horas.
Proporcione agua del grifo con una botella de lavado para mantener el yeso húmedo cada dos días a la misma hora. A continuación, agregue alrededor de 100 microgramos de polvo de grillo seco envuelto en papel de aluminio y una punta llena de agua de azúcar morena a la colonia, usando una punta de 20 microlitros cada dos días hasta que surjan nuevas hormigas reproductivas. Es importante recoger micro colonias de los campos y proporcionarles suficiente comida para obtener nuevas reinas y machos.
En primer lugar, evitar que los individuos se muevan colocando colonias en una habitación con un entorno controlado establecido en cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Retire las patas medias de 30 hormigas trabajadoras usando fórceps bajo un estereoscopio para distinguir la generación F-cero de los trabajadores producidos en cruces de endogamios subsiguientes. A continuación, transfiera las hormigas a un nuevo nido de yeso más pequeño para cruces de endogamina.
A continuación, agregue tres a cuatro larvas o pube en un nido de yeso que contenga trabajadores. Transfiera una larga reina alada y un macho a un nido de yeso previamente preparado para cruces endogamios. Para este paso, es importante mantener la colonia de cruce experimental en el mismo estado que la de una colonia normal.
Es difícil inducir la endogamia simplemente colocando machos y hembras juntos. Mantenga las colonias a 25 grados centígrados bajo un ciclo de 16 a ocho horas de luz, oscuro con alimentos y agua proporcionados hasta que la reina pierda sus alas y pone huevos. Revise la colonia experimental todos los días bajo un microscopio estéreo.
Después de configurar los cruces de endogamina entre la descendencia F-uno, los huevos se pueden observar bajo un estereoscopio. Después de que la reina F-one comienza a poner huevos, retire a los machos F-uno y larvas o pube del nido para evitar que la generación F-uno y la generación F-dos se mezclen. Mantener las colonias en las mismas condiciones hasta que surjan los F-dos.
Retire una pierna de una reina F-cero usando fórceps. Transfiera la pierna a un microtubo de 1,5 mililitros que contenga 100 microlitros de un agente frío. Bajo un estereoscopio diseccionar un abdomen femenino en un plato de vidrio lleno de 300 microlitros de agua ultra pura usando fórceps.
Disimilar la espermatozoide que contiene los espermatozoides de los machos apareados. Pelar el tejido de la espermatica y aislar el esperma del tejido de la hembra utilizando alfileres de insectos. Usando una almohadilla micro tarta, transfiera el esperma a un microtubo de 1,5 mililitros que contenga 100 microlitros de un agente frío.
Incubar las muestras de la reina F-cero y los espermatozoides a 95 grados Celsius durante 20 minutos. Flash centro fusiona el microtubo y almacena las muestras a cuatro grados Centígrados. Después de confirmar la producción de óvulos por la reina F-one, extraiga el ADN de la reina usando las alas de un peldato o una pierna media y un genotipo.
A continuación, extraiga el ADN de un macho F-uno genotipando una pierna. Para evaluar la fertilidad de las hormigas macho de las cruces endogamios, disecciona los órganos reproductivos internos en un plato de vidrio con 400 microlitros de solución PBS utilizando fórceps. A continuación, retire el PBS y reemplácelo con un cuatro por ciento de paraformaldiído utilizando una almohadilla micro tarta.
Fijar el tejido incubando las muestras en PFA durante cuarenta minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, lave los tejidos cinco veces con 400 microlitros de PBS usando una almohadilla micro tarta. Diluir la solución DAPI a un miligramo por mililitro en PBS.
Retire el PBS y agregue aproximadamente 300 microlitros de la solución de tinción DAPI diluida al tejido. Incubar el tejido durante 15 minutos bajo condiciones oscuras a temperatura ambiente. Después de la incubación, lavar el tejido cinco veces con 400 microlitros de PBS y transferir el tejido al centro de un portaobjetos de vidrio utilizando fórceps.
A continuación, monte el tejido en un medio de montaje que contenga tetrametilrhodamine TRITC. Finalmente observe las muestras con un microscopio de escaneo láser confocal utilizando las lentes objetivo 20 o 60 3x. Las imágenes microscópicas de testículos de Haploid male v Emeryi muestran tejido fibroso sano o espermatozoides que están ausentes en El hombre diploide v Emeryi, que no mostraba tejido fibroso sano.
Los órganos reproductores masculinos de Diploid male v Emeryi no produjeron espermatozoides y sus testículos no se desarrollaron, lo que sugiere que los machos producidos en cruces de endogamios son estériles. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para explorar la miatonía sexual en una constante en Vollenhovia Emeryi para la especie de hormiga de tiempo rápido.
