Los autores agradecen a NSF (MCB-1157876) para su financiación. También queremos agradecer a Alberto Civetta, John Roote y dos árbitros anónimos por sus comentarios.

Experimentos a pequeña escala se debe realizar para familiarizarse con todo el procedimiento. 1. Recopilación de hembras vírgenes y hombres de Naïve La versión más simple del experimento descrito consta de cuatro tipos de cruces iniciales, que implican la combinación de los adultos: a) w particulares 1118 con el fin de recoger las hembras vírgenes, b) Oregon-R individuos con el fin de recoger los varones referencia ingenuos, c ) P {sw} machos homocigotos y hembras vírgenes de una línea de control que lleva a la organización de tipo salvaje de SDIC el fin de recoger los machos experimentales tratados previamente (tipo I), y d) P {sw} machos homocigotos y SDIC-sw-supresión -llevar a hembras vírgenes con el fin de recoger los machos experimentales no tratados previamente que llevan la deficiencia de NaDCC-sw (Tipo II). <ol><li> Configurar múltiples viales que contienen 8-10 mujeres y 5 hombres cada una. Permitir que las hembras ponenhuevos y transferir los adultos a los nuevos viales cada 3-5 días. Utilice botellas en lugar de viales si es necesario y utilizar siempre los alimentos frescos. El número de viales necesarios dependerá del número de tipos de machos experimentales en estudio y el número de individuos que se estima necesario para detectar diferencias (Tabla 1). Más de 10 hembras por vial podrían resultar en el hacinamiento durante el crecimiento de las larvas, que pueden causar variaciones en la fertilidad de la progenie. Guarde los viales a 25 ° C en una cámara de temperatura controlada. </li><li> Comience a recoger hembras vírgenes y machos ingenuos en los días 11 y 12 de noviembre después de la creación de los cruces iniciales. El período de espera varía en función de la temperatura; inferior resultado temperaturas en el tiempo de desarrollo más largo retraso de la colección de individuos. Otro factor que afecta el tiempo de eclosión es el tipo de medio. Alimentos nutritivos, como medio de harina de maíz, la levadura 29, asegura el correcto desarrollo del adultosistema reproductivo, lo que facilita el apareamiento. Recoger unmated vuela cada 4-6 horas. Al recoger, anestesiar moscas mediante la introducción de CO 2 en el vial, toque las moscas hacia abajo, y el sexo a bajo microscopio estereoscópico (Figura 2). Coloque las moscas deseadas en diferentes viales por sexo y fenotipo y la etiqueta de los viales adecuadamente. </li></ol> Nota 1. Colección rutina comienza en la mañana descartando los adultos que emergieron durante la noche anterior. Recoger las hembras vírgenes y machos ingenuos una o dos veces durante el día. Típicamente, D. los machos alcanzan la madurez sexual melanogaster 8 horas después de la eclosión a 25 ° C 30. Si las moscas se mantuvieron en ciclos de luz / oscuridad 12:12 h, se espera que dos picos de eclosión: durante la primera 1-2 horas después de que la luz se enciende, y durante la 2 horas antes de la luz se apaga. Eclosión ocurre dentro de 24 horas después de la pupa se oscurece. Nota 2. No más de 10 mujeres shía ser puesto en el mismo vial para evitar el hacinamiento. Esto limita también la pérdida de las hembras en el caso de que tengan que ser descartado, porque al menos uno de ellos no es virgen. Nota 3. Con el fin de recoger la cantidad apropiada de hembras vírgenes y machos ingenuos en un corto período de tiempo, las siguientes medidas pueden adoptarse. Configure 15-20 frascos de 1118 w de experimentos con dos tipos de machos experimentales (Tabla 1). Espolvorear ligeramente la superficie de los medios de comunicación y añadir unas pastillas de levadura seca activa para facilitar la oviposición. Traslado padres por lo menos 4 veces en días consecutivos. Para aumentar la superficie disponible para la fase de pupa en cada vial, inserte el papel multi-plegada (7 x 5 cm) durante el 4 º o 5 º día después de que los padres se transfieren a otro vial (Figura 3). Si el número de adultos emergidos de las cruces inicial no es suficiente, esperar unos días más y cobrar individualmenteALS de viales establecidos en diferentes fechas. Plan para llevar a cabo los experimentos durante varios días consecutivos para igualar la carga de trabajo. 2. Experimentos doble de apareamiento La figura 4 muestra las principales etapas implicadas en experimentos de doble acoplamiento realizadas en 14. <ol><li> En la mañana del día 1, creó el primer apareamiento. Los machos Oregon-R son el primero para acoplarse en el ensayo de delito. <ol><li> Usando el aspirador, creado viales conteniendo 10 4 a 5 días de edad, de ojos blancos w hembras vírgenes 1118 y 10 de ojos rojos Oregon-R machos ingenuos cada uno. Dos a tres viales se configuran al día durante 5 días consecutivos. El número de viales necesarios para la creación puede variar en función del número de personas disponibles. Permita que las moscas para aparearse durante 2 horas. </li><li> Descartar Oregon-R machos y colocar cada hembra en un nuevo vial utilizando un aspirador (Figura 5). La identificación del sexo se puede lograr mediante la inspección visual de unos pocosdiferencias morfológicas (Figura 2). Marque cada vial adecuada y dejar a la hembra en el vial durante 2 días (en adelante &quot;v1&quot;). </li></ol></li><li> El día 3, configure el segundo acoplamiento. Selección de los varones y transversales establecidos se debe realizar al azar con el fin de minimizar cualquier sesgo potencial hacia cualquiera de los tipos masculinos experimentales. <ol><li> Dos horas antes de que la luz está apagada, vuelva a transferir a la mujer a un nuevo vial con un aspirador. Marque el nuevo vial adecuada (en lo sucesivo &quot;v2&quot;). </li><li> Introducir tres 5-6-días de edad, machos experimentales del mismo genotipo en v2. </li><li> Repita 2.2.1 y 2.2.2 para cada mujer. </li><li> El día 4, a dos horas justo antes de la luz se activa (es decir, no más de 12 horas después de la 2.2.1), desechar los hombres mediante el aspirador. </li></ol></li><li> En el Día 6, transferir cada hembra de nuevo en otro frasco nuevo. Etiquetar los nuevos viales debidamente (en adelante &quot;v3&quot;). </li><li> El día 10, deseche el 1118 w </sup&gt; hembras. </li><li> Examine las progenies en v2 y v3. La primera inspección se lleva a cabo después de 13-15 días después de que se introdujo la hembra en v2 (o V3), por ejemplo, en el día 17 después de la primera hembra oviposición se inició en v2. La segunda inspección se realiza exactamente después de 17 días. Este período de tiempo representa un límite temporal máximo de seguridad que garantiza que no habrá segunda generación en el mismo vial. Dos inspecciones evitar el hacinamiento, facilitando conteo progenie. <ol><li> El día 17, inspeccione v1 y asegurar que hay descendencia de ojos rojos presentes, si no marcar el vial en consecuencia. Presencia de la progenie de ojos blancos indica que la hembra no era virgen en el momento de apareamiento inicial mientras que ninguna progenie indica que el apareamiento con la referencia o los machos experimentales no ocurrir. </li><li> El día 17, lleve a cabo la primera inspección de la v2. Anesthetize surgió progenie en v2 con CO 2 y ordenarlos por color de los ojos y el sexo. Números de progenie Registro engendrados por el primer y segundomachos ond. Figura 6 muestra los fenotipos esperados en la progenie de cada esquema de apareamiento. En este experimento en particular 14, sólo progenie femenina se puede asignar de forma inequívoca como engendrado por la referencia o los machos experimentales y por lo tanto sólo la información de las hijas se puede utilizar para calcular P 2. Si con otros marcadores de la paternidad de la descendencia masculina se puede asignar de forma inequívoca, los recuentos de progenie de ambos sexos pueden ser utilizados en los cálculos posteriores. Deseche la progenie, pero mantener v2 de segunda inspección. </li><li> El día 20, proceder como en 2.5.2 con la progenie de reciente creación en v2 y luego desechar el vial. </li><li> En el Día 20, inspeccionar la progenie surgido en v3 por primera vez y siga el paso 2.5.2. </li><li> El día 23, proceder como en 2.5.3 con la progenie de reciente creación en v3. </li></ol></li></ol> Nota 1: Debido al potencial efecto de inflar las puntuaciones de P que el apareamiento múltiple podría tener (2.2.2 y 2.2.3), el apareamientopuede ser limitado a un lapso de tiempo determinado. El marco de tiempo dependerá de la frecuencia de aparearse de nuevo asociado con el genotipo de la hembra y machos usados. La probabilidad de apareamiento múltiple es especialmente reducido durante la noche 11. Nota 2: No añadir pastillas de levadura vivas, ya que esto podría causar problemas debido al potencial de crecimiento excesivo de la levadura cuando el número de moscas adultas es baja. 3. Análisis de Datos <ol><li> Cuenta progenie grabados deben organizarse adecuadamente para facilitar la inspección visual y análisis eficiente con un paquete estadístico adecuado (por ejemplo JMP de SAS Institute) o herramientas gratuitas basadas en la Web (por ejemplo <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a> ). </li><li> Capacidad competitiva de esperma. Añadir cuenta de v2 y v3. Las moscas hembras que han dado lugar a ninguna o muy limitada progenie (por ejemplo, &lt;10), fallecido durante el procedimiento, o sólo de éxito inseminaciónted por uno de los dos hombres se consideran como no-informativo y están excluidos de cualquier análisis estadístico posterior (2.5.1 y Tabla 2). Calcular la puntuación P 2 para cada mujer informativo. </li><li> Probar si existen diferencias estadísticamente significativas en los valores de P 2 entre los machos experimentales comparados. Esto puede hacerse usando pruebas no paramétricas (por ejemplo de acero-Dwass) dependiendo de varios factores, incluyendo la asimetría de la distribución de los valores de P 2 y la dependencia entre la varianza y la media paramétrica (HSD de Tukey por ejemplo) o. La transformación angular se aplica comúnmente a proporciones tales como P 2 antes de que el uso de pruebas no paramétricas 31. </li><li> Diferencias de acoplamiento (opcional). Para cada tipo macho experimental, calcular el número de las hembras apareadas por partida doble y los que sólo se apareó con el primer macho (el macho de referencia en el ensayo de ataque y el macho experimental en el densayo efense). Uso de una prueba exacta de Fisher de dos colas (disponible en <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a> ), determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre los dos tipos de machos experimentales. </li><li> Tasa de masculinidad (opcional). Para cada hombre experimental, utilice la prueba de chi-cuadrado para determinar si la proporción de sexos en la descendencia de cada hembra se desvía de la proporción esperada de 1:1. </li></ol>

<ol>
	<li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The descent of man and selection in relation to sex. , (1871).</li><li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects.">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).</li><li>Birkhead, T. R., M&#248;ller, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm competition and sexual selection. , (1998).</li><li>Jones, B., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+sperm+competition+estimates.">Bayesian sperm competition estimates.</a> Genetics. 163, 1193-1199 (2003).</li><li>Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+and+sperm+displacement+in+natural+populations+of+Drosophila+melanogaster.">Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster.</a> Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).</li><li>Jonsson, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+transfer,+storage,+displacement,+and+utilization+in+Drosophila+melanogaster.">Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 47, 1719-1736 (1962).</li><li>Boorman, E., Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+(ejaculate)+competition+in+Drosophila+melanogaster,+and+the+reproductive+value+of+females+to+males+in+relation+to+female+age+and+mating+status.">Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status.</a> Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).</li><li>Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. , 372-427 (1984).</li><li>Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+sperm+displacement+and+its+association+with+accessory+gland+protein+loci+in+Drosophila+melanogaster.">Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 139, 189-201 (1995).</li><li>Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+x+male+interactions+in+Drosophila+sperm+competition.">Female x male interactions in Drosophila sperm competition.</a> Science. 283, 217-220 (1999).</li><li>Civetta, A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+effects+on+male+and+female+components+of+sperm+precedence+in+Drosophila.">Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila.</a> Genet. Res. 75, 143-151 (2000).</li><li>Greenspan, L., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+variation+in+X+chromosome+male+reproductive+genes+and+sperm+competitive+ability+in+Drosophila+melanogaster.">Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster.</a> Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).</li><li>Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+male+accessory+gland+protein+Acp36DE+in+sperm+competition+in+Drosophila+melanogaster.">The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).</li><li>Yeh, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evidence+that+a+recently+evolved+Drosophila+sperm-specific+gene+boosts+sperm+competition.">Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).</li><li>Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+multiple+kinds+of+female+sperm-storage+organs+in+Drosophila.">Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila.</a> Evolution. 53, 1804-1822 (1999).</li><li>Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ejaculate-female+coevolution+in+Drosophila+mojavensis.">Ejaculate-female coevolution in Drosophila mojavensis.</a> Proc. Biol. Sci. 270, 1507-1512 (2003).</li><li>Nonidez, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+phenomenon+of+reproduction+in+Drosophila.">The internal phenomenon of reproduction in Drosophila.</a> Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).</li><li>Miller, G. T., Pitnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-female+coevolution+in+Drosophila.">Sperm-female coevolution in Drosophila.</a> Science. 298, 1230-1233 (2002).</li><li>Manier, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+mechanisms+of+competitive+fertilization+success+in+Drosophila+melanogaster.">Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster.</a> Science. 328, 354-357 (2010).</li><li>Simmons, L., Siva-Jothy, M., Birkhead, T. R., M&#248;ller, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm competition and sexual selection. , 826 (1998).</li><li>Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+remating,+sperm+competition+and+sexual+selection+in+Drosophila.">Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila.</a> Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).</li><li>Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+investigation+of+the+mating+system+of+Drosophila+hydei.">A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei.</a> Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).</li><li>Barbadilla, A., Quezada-D&#237;az, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+history+of+Drosophila+buzzatii.+XVII.+Double+mating+and+sperm+predominance.">The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance.</a> Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).</li><li>Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+sperm+competition+and+sperm+storage+in+Drosophila.">Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila.</a> Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).</li><li>Turner, M. E., Anderson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+predominance+among+Drosophila+pseudoobscura+karyotypes.">Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes.</a> Evolution. 38, 983-995 (1984).</li><li>Harshman, L. G., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inference+of+sperm+competition+from+broods+of+field-caught+Drosophila.">Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila.</a> Evolution. , 1334-1341 (1998).</li><li>Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+in+wild+Drosophila+melanogaster+revisited+by+microsatellite+analysis.">Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis.</a> Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).</li><li>Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+between+Drosophila+males+involves+both+displacement+and+incapacitation.">Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation.</a> Nature. 400, 449-452 (1999).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly+Pushing:+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics.">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics.</a> , (1997).</li><li>Sokal, R. R., Rohlf, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , (1994).</li><li>Clark, A. G., Begun, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+genotypes+affect+sperm+displacement+in+Drosophila.">Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila.</a> Genetics. 149, 1487-1493 (1998).</li><li>Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontransitivity+of+sperm+precedence+in+Drosophila.">Nontransitivity of sperm precedence in Drosophila.</a> Evolution. 54, 1030-1035 (2000).</li><li>Wigby, S., Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition.">Sperm competition.</a> Curr. Biol. 14, 100-102 (2004).</li><li>Pizzari, T., Parker, G. A., Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm biology: an evolutionary perspective. , 674 (2008).</li><li>Ram, K. R., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminar+influences:+Drosophila+Acps+and+the+molecular+interplay+between+males+and+females+during+reproduction.">Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction.</a> Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).</li><li>Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+sperm+competition+and+sperm+competition+avoidance+in+Drosophila+melanogaster.">Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos descrito el diseño experimental para evaluar las diferencias en la contribución relativa de genéticamente distinta D. melanogaster hombres a la progenie en los experimentos de doble acoplamiento controlados 7,8. Esto se ha hecho en el contexto de un factor genético planteado la hipótesis de influir en la capacidad competitiva de esperma y se ha ilustrado en el ensayo de delito aunque se aplica un procedimiento similar al ensayo de defensa (Figura 1). Este diseño experimen...

Desde Geoff Parker señaló que la prevalencia de la competencia espermática en los insectos y sus implicaciones evolutivas 2, una oleada de estudios en Drosophila y otras especies han tratado de arrojar algo de luz sobre este fenómeno en muchos niveles diferentes. Algunos ejemplos de las áreas de interés han sido el estudio de la variación de las poblaciones naturales de 9,10, su arquitectura genética subyacente y la relevancia de los factores genéticos 11-14, y su papel en la coevolución entre los sexos 15,16 conducción. En D. hembras melanogaster, la capacidad limitada de los órganos de esperma de almacenamiento especializados, un par de espermateca y el receptáculo seminal 6,17, contribuye a la competencia de los espermatozoides de diferentes machos. Aproximadamente 1.500 espermatozoides se transfieren durante el apareamiento de la hembra, pero sólo ~ 500 pueden alojarse en los órganos mencionados 18,19. En el laboratorio, controlado, doble acoplamiento experimentalciones que implican un hombre de referencia y uno o más machos de interés se han utilizado ampliamente para evaluar la capacidad competitiva de espermatozoides 7,8. Capacidad competitiva de esperma se calcula como la proporción de la progenie engendrado por el macho experimental en los experimentos de doble acoplamiento sobre la progenie total, es decir que a partir de tanto el grupo experimental y los machos de referencia. Capacidad competitiva de esperma comprende dos componentes, cada uno de ellos evaluado en un ensayo separado. En el ensayo de infracción, la capacidad del esperma masculino experimental para desplazar el esperma desde el primer macho, es decir, el macho de referencia, se evalúa. Por el contrario, en el ensayo de defensa, la capacidad del esperma masculino experimental para resistir el desplazamiento o para reducir el éxito de la fertilización de la esperma masculino referencia se evalúa. Dependiendo del tipo de ensayo, la defensa o ataque, la capacidad competitiva de espermatozoides se calcula a través de las puntuaciones de P1 o P2, respectivamente. P1 y P 2 sólo puede tomar valores entre 0 y 1. Los valores intermedios suelen interpretarse como evidencia indirecta de semen mezclado, lo que sugiere una situación fisiológica que implica la competencia de esperma directa. Siguiendo el mismo razonamiento, valores extremos pueden ser interpretados como evidencia de la fuerte diferencial de esperma capacidad competitiva. Los primeros estudios mostraron que P 2 en D. melanogaster es más de 0.8 aumentando a medida que el tiempo transcurrido entre los dos apareamientos alarga 7. Este mismo diseño experimental se ha utilizado en otras especies de Drosophila, P 2 siendo la estadística comúnmente utilizado en los estudios para evaluar la capacidad competitiva de esperma 20. Para la mayoría de las especies, los valores de P 2 de las cepas ensayadas es mayor que 0,6 21. Sin embargo, otros mecanismos no relacionados con la competencia directa entre los espermatozoides de diferentes machos pueden producir resultados idénticos (ver Discusión). Dprogenie istinguishing engendrado por los primeros o segundos machos es posible mediante el uso de marcadores fácilmente identificables. En los primeros estudios, uno de los machos se irradió a dosis subletales de, por ejemplo, rayos-X de tal manera que prácticamente todos los óvulos fertilizados por el esperma irradiado no eclosionó 7. Posteriormente, las mutaciones que alteran la pigmentación de los ojos o la forma del ala han sido los marcadores más utilizados. Ejemplos de los primeros son las mutaciones de peso corporal (marrón) 9, cn (cinabrio) y 22 W (blanco) 23, mientras que la mutación Cy (rizado) 24 se corresponde con el segundo tipo de fenotipos; algunas de estas mutaciones se han combinado en el mismo individuo, por ejemplo, cn peso corporal. En menor medida, alozimas 25 y microsatélites 26,27 con patrones de herencia conocidos también se han utilizado. El diseño experimental para probar las diferencias encapacidad competitiva de esperma se describe aquí sigue esencialmente el de Clark et al. 9. Los resultados derivados de estos experimentos dan información únicamente acerca de la paternidad diferencial de los tipos masculinos experimentales bajo escrutinio. Los ensayos, que también tienen en cuenta las diferencias después de la fertilización en la aptitud 14,28 y técnicas de visualización de esperma 24 permiten a las diferencias en P 1 o P (2) resultados sean interpretados como diferencias en la competencia espermática. La figura 1 resume los fundamentos tanto de la infracción y los ensayos de defensa. Para ilustrar la logística del proceso, un experimento delito lleva a cabo en D. melanogaster 14 se explicará en detalle. Este ensayo delito en particular se utilizó para la prueba de un efecto mensurable de la familia de cadena intermedia dynein esperma específico multigénica (SDIC) de la capacidad competitiva de esperma. Todo el miembros de esta familia multigénica residen en tándem en el cromosoma X. Machos Knockout se generaron mediante la supresión de la agrupación NaDCC. Debido a que el segmento eliminado también incluye el gen esencial ala corta (SW) y el propósito del estudio fue evaluar la relevancia de NaDCC, los machos que llevan la deleción NaDCC-sw fueron rescatados por una copia transgénica de sw (simbolizado como P {sw} , que también llevó a un gen reportero mini-blanco) en el cromosoma 2. Mis ojos se utilizó como un marcador visible para la identificación de paternidad. Todas las moscas estaban en un mutante de fondo blanco con la excepción de los de la cepa Oregon-R, que se utilizaron como referencia los machos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amber latex tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62996-473</td>
			<td>1/4 inch ID, 1/6 inch Wall</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml graduated XL filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mesh Fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thin and smooth</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td>Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FlyStuff Foot Valve, complete system</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121C</td>
			<td>Not necessary if FlyNap is used</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Come with carboard trays that can be reused for holding vials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-212</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td>Found in general grocery store</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Different colors may be used for marking different genotypes</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

assessing differences in sperm competitive ability in drosophila

La competencia entre los machos conespecíficos para fertilizar los óvulos es uno de los mecanismos de selección sexual, es decir, selección que opera en maximizar el número de eventos de apareamiento con éxito en lugar de sobre la supervivencia y la maximización de la viabilidad 1. La competencia de esperma representa la competencia entre los machos después de copular con la misma hembra 2, en el que sus espermatozoides son coincidentes en el tiempo y el espacio. Este fenómeno se ha informado en varias especies de plantas y animales 3. Por ejemplo, silvestres D. hembras melanogaster por lo general contienen esperma 2-3 machos 4. Los espermatozoides se almacenan en órganos especializados con limitada capacidad de almacenamiento, lo que podría dar lugar a la competencia directa de los espermatozoides de diferentes machos 2,5. Comparando los espermatozoides capacidad competitiva de los diferentes machos de interés (tipos masculinos experimentales) se ha realizado a través de la experimentación de doble acoplamiento controladots en el laboratorio 6,7. En pocas palabras, una sola hembra está expuesto a dos machos diferentes consecutivamente, uno masculino experimental y un macho de referencia cruzada de apareamiento. El mismo esquema de apareamiento es seguido utilizando otros tipos masculinos experimentales, facilitando así la comparación indirecta de la capacidad competitiva de su esperma a través de una referencia común. La fracción de individuos engendrados por los machos experimentales y de referencia se identifica usando marcadores, que permite estimar la capacidad competitiva de espermatozoides usando expresiones matemáticas simples 7,8. Además, la capacidad competitiva de esperma puede ser estimado en dos escenarios diferentes dependiendo de si el macho experimental es segundo o primero para aparearse (delito y ensayo de defensa, respectivamente) 9, que se supone que ser el reflejo de diferentes atributos de competencia. Aquí se describe un método que ayuda a interrogar al papel de los diferentes factores genéticos que supuestamente subyacen tque fenómeno de la capacidad competitiva de esperma en D. melanogaster.

La tabla 2 resume algunas de las características más destacadas de dos experimentos delito (ensayos 1 y 2) en el que D. melanogaster machos experimentales con y sin (Tipo I y II, respectivamente) un grupo funcional NaDCC se comparan 14. Después de tomar en cuenta las diferentes incidencias encontradas con algunas repeticiones, 58-83% de las mujeres resultaron ser de carácter informativo, por lo que los recuentos de paternidad de su progenie se podrían utilizar para el c...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila at JoVE.com

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Diferencial espermatozoides capacidad competitiva entre<em&gt; Drosophila</em&gt; Machos con genotipos distintos se pueden determinar a través de experimentos de doble contacto. Cada uno de estos experimentos consiste en uno de los machos de interés y un macho de referencia. Marcadores fácilmente identificables en la progenie permiten la inferencia de la fracción de individuos engendrados por cada macho.

Diferencias Evaluación de Capacidad Competitiva de espermatozoides en<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

assessing-differences-in-sperm-competitive-ability-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

14.5K vistas.  University of California, Irvine. Diferencial espermatozoides capacidad competitiva entre Drosophila Machos con genotipos distintos se pueden determinar a través de experimentos de doble contacto. Cada uno de estos experimentos consiste en uno de los machos de interés y un macho de referencia. Marcadores fácilmente identificables en la progenie permiten la inferencia de la fracción de individuos engendrados por cada macho.

Video: Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescencia In situ</emHibridación> (FISH) Protocolo en el esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Investigación

Biología

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Técnicas de Imagen Ca 2 + Señalización en el esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

El aislamiento y la In vitro La activación de Caenorhabditis elegans El esperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualización y seguimiento de ARNm endógenos en cámaras de huevo Drosophila melanogaster en vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Rendimiento medio de selección de ensayos para la evaluación de efectos sobre la Ca2 +-señalización y reacción acrosómica en espermatozoides humanos

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Evaluación de la capacidad fagocítica específica por edad de los hemocitos de Drosophila melanogaster adultos utilizando un ensayo de fagocitosia In Vivo

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Disección, fijación y visualización del Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...