Nuestro laboratorio utiliza Drosophila melanogaster para identificar y caracterizar genes y vías que regulan la función mitocondrial durante el desarrollo y la homeostasis fisiológica. El protocolo presentado aquí utiliza imágenes en vivo con la adición de peróxido de hidrógeno para visualizar los efectos del daño oxidativo en la localización y dinámica de las estructuras subcelulares en el ovario adulto de Drosophila. Con frecuencia utilizamos protocolos de diagnóstico por imágenes para estudiar cómo las mutaciones alteran la localización y el movimiento mitocondriales normales en las células germinales femeninas.
En el transcurso de nuestros estudios encontramos que el estrés introducido por la disección u otros factores estresantes celulares tuvo un profundo impacto en la localización mitocondrial. Como control para identificar si el estrés general, a diferencia del tratamiento experimental, es la causa de cualquier cambio en la localización o el comportamiento de las estructuras subcelulares. Desarrollamos este protocolo para introducir el estrés de control utilizando peróxido de hidrógeno.
En este video, demostraremos cómo el daño oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno cambia la distribución de las mitocondrias y la ribonucleoprotein Clu. Los medios más adecuados para esta técnica de imágenes en vivo contenían los medios Drosophila de Schneider que contenían 15% de suero bovino fetal inactivado por calor, 0,6 X Pen-Strep y 200 microgramos por insulina bovina microlitro, en lo sucesivo denominados medios completos de Schneider. La realización de la preparación de los medios bajo condiciones estériles garantizará que no se contamine.
Mezcle bien el contenido y almacene durante la noche a cuatro grados. La insulina no se disuelve por completo en los medios completos de Schneider y notará un precipitado asentarse en la parte inferior del tubo. Haz aliquots, asegurándome de dejar esto precipitado, ya que interferirá con las imágenes.
Esta solución se puede utilizar durante un mes si se almacena en alícuotas a cuatro grados. Para obtener imágenes óptimas de células germinales femeninas, primero prepare un vial que contenga un toque de pasta de levadura húmeda que sea la consistencia de la mantequilla de maní. Esto garantiza que las hembras estén bien alimentadas y produzcan todas las etapas de desarrollo folículo para la toma de imágenes.
Para moscas óptimamente sanas, recoger cero a un día hembras viejas y transferir con los machos en un vial de alimento mosca que contiene pasta de levadura húmeda. Asegúrese de que las moscas durmientes no se pongan en contacto con la pasta de levadura, ya que pueden pegarse a ella. Alimenta a las moscas de tres a siete días, cambiando la pasta de levadura diariamente.
Asegúrese de que la pasta de levadura entre en contacto con el alimento para moscas, para que no se seque. Para inducir daños oxidativos, utilizaremos una solución de stock de peróxido de hidrógeno al 30% y para visualizar mitocondrias, utilizaremos una solución de stock de 100 mililitros TMRE. Es importante preparar las soluciones multimedia frescas porque el peróxido de hidrógeno es susceptible a la oxidación y TMRE se degrada con el tiempo.
Justo antes de la disección, en los medios de comunicación completos de Schneider, preparar una nueva alícuota de dos peróxidos de hidrógeno micromolares, un aliquot fresco de 46 TMRE nanomolar, y un aliquot fresco de 46 TMRE nanomolar más dos peróxidos de hidrógeno micromolares. Para la disección del ovario necesitarás dos pares de fórceps finos y un par de agujas de tungsteno electrolíticamente afiladas. Para diseccionar los ovarios llene un vaso de reloj con los medios completos de Schneider que ha sido calentado a temperatura ambiente, luego coloque una sola mosca en los medios de comunicación usando fórceps.
Sujete suavemente la mosca por el tórax usando un par de fórceps finos. Con los otros fórceps, sujete el trasero y tire suavemente para extirpar los ovarios. Retire cualquier cutícula o tejido extraño y, a continuación, transfiera el ovario a un nuevo pozo que contenga medios frescos.
Los ovarios todavía deben moverse de la vatina muscular circundante. Con las agujas de tungsteno afilados, se burla suavemente de los ovarioles, teniendo cuidado de eliminar la colícula muscular circundante. Si no se extirpa la vatina muscular, como se muestra aquí, la ovaria temblará, causando problemas con la adquisición de imágenes.
Una vez diseccionados limpiamente los ovarioles, transfiéralos en una caída de 100 microlitros de medios a un plato MatTek si visualiza estructuras endógenamente etiquetadas. Transfiera los ovarioles en una caída de 100 microlitros de medios TMRE a un plato MatTek si visualiza mitocondrias etiquetadas con TMRE. Los ovarioles se hundirán en la parte inferior de la gota.
Es importante practicar disecciones con el fin de comenzar a tomar imágenes del tejido lo más rápido posible. Una vez montados los ovarioles, coloque el plato en el microscopio invertido y adquiera imágenes fijas o videos breves como un registro de las condiciones de pretratamiento. Una vez hecho esto, pausa las imágenes en vivo, retira la tapa y añade cuidadosamente 100 microlitros de la solución preparada para peróxido de hidrógeno micromolar.
Evite romper la superficie de la gota de soporte existente o agregar la solución demasiado rápido, para no desplazar los ovarioles que descansan en la parte inferior. Reemplace la cubierta del plato, reubique y reenfoque el ovariole deseado, y reanude las imágenes. Cuídate de reanudar las imágenes lo más rápido posible, ya que el tratamiento experimental es sensible al tiempo.
Aquí se muestran imágenes fijas de una película, tomadas después del tratamiento con peróxido de hidrógeno. Las mitocondrias y las células germinales femeninas se dispersan a lo largo del citoplasma cuando las moscas están bien alimentadas y sanas. Después de la adición de peróxido de hidrógeno, el daño oxidativo hace que las mitocondrias se agrupen, lo que se puede ver tan rápido como 10 minutos después del tratamiento.
Después de 20 minutos, el daño hace que el potencial de membrana mitocondrial se disipe. Por lo tanto, la mayoría de las mitocondrias se desvanecen. En esta película en vivo del proceso, las mitocondrias se pueden ver rápidamente aglutinando y la mayoría de las mitocondrias finalmente se desvanecen.
El parpadeo pulsante en el citoplasma, particularmente en las células folículos circundantes, parece característico de la adición de TMRE. Como se mencionó anteriormente, las imágenes deben tener lugar rápidamente después de la adición de peróxido de hidrógeno. Como se muestra aquí, si transcurre demasiado tiempo, el potencial de membrana mitocondrial ya se pierde y el etiquetado TMRE se disipa, haciendo que los datos sean ininterpretables.
En estas imágenes fijas de vídeo, las partículas Clu etiquetadas endógenamente GFP son robustas y abundantes en el germoplasma de hembras bien alimentadas. Después de la adición de peróxido de hidrógeno, las partículas Clu se dispersan en 10 minutos. Esto se demuestra en el video que lo acompaña.
Después de la adición de peróxido de hidrógeno, las partículas de felicidad Clu se dispersan rápidamente. Hemos encontrado que este protocolo es una herramienta útil para asegurar imágenes precisas de la localización de mitocondrias de tipo salvaje y partículas de Clu bliss en células germinales femeninas de Drosophila. Este protocolo debe ser aplicable para una amplia gama de estudios de imágenes en vivo y podría utilizarse para tratar tejidos antes de la fijación también.
Los pasos más importantes son aislar los ovarioles libres de la vaina muscular, para añadir suavemente el peróxido de hidrógeno, para no desalojar los ovarioles, e imagen rápidamente después de la adición de peróxido de hidrógeno. Esperamos que encuentre este un control útil para la toma de imágenes en vivo de una variedad de estructuras subcelulares. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.
