Desarrollamos un método llamado litografía de biopelícula para iluminar una superficie, y las bacterias se acumulan donde está la luz. Este método nos permitirá responder a preguntas clave en la investigación de biopelículas, por ejemplo, cómo las estructuras espaciales afectan las funciones de la comunidad. Hay muchas ventajas para este método.
Por ejemplo, funciona a una resolución muy alta de 25 micrómetros, no requiere pre-patrón de superficie, y también funciona dentro de dispositivos fluidos cerrados. Aunque este método puede proporcionar información sobre la relación estructura-función de las biopelículas naturales, también se puede aplicar a otras disciplinas, como la ingeniería de biopelículas, los biomateriales y la biología sintética multicelular. La demostración visual de este método es fundamental, ya que hay pasos preliminares clave para preparar la configuración del cultivo óptico y la muestra bacteriana antes del patrón de biopelícula.
En primer lugar, transformar el plásmido pDawn-Ag43 en la cepa E.coli de interés, y la placa en una placa de agar LB complementada con espectinomicina. Inocular una sola colonia en caldo de LB con espectinomicina en un tubo de cultivo, y crecer a fase exponencial en una incubadora de temblores a 250 rpm y 37 grados centígrados. Después de la inoculación, preparar un 25%de glicerol de la cepa transformada pDawn-Ag43 mezclando un mililitro de 50% de glicerol estéril con un mililitro de cultivo en un criotubo.
Almacene el stock en un congelador celsius de menos 80 grados. A continuación, comience a preparar la configuración óptica colocando un proyector portátil en la parte inferior de una incubadora bacteriana con la abertura apuntando directamente hacia arriba en el techo, donde se conectará la cámara de cultivo de biopelícula. Conecte un ordenador portátil a través del cable de visualización al proyector dentro de la incubadora.
Utilice cinta adhesiva para fijar un plato de cultivo ficticio vacío al techo de la incubadora. Ajuste el enfoque en el proyector girando la perilla de enfoque de modo que el plano de enfoque coincida con la superficie inferior de la placa de cultivo de biopelícula unida al techo de la incubadora. El proyector debe iluminar una imagen nítida y no borrosa en la parte inferior del plato de cultivo.
Retire el plato de cultivo ficticio una vez que la proyección ha sido optimizada. Con el software para portátiles, dirija el proyector para iluminar todo el campo de visión con la máxima iluminación azul presentando una diapositiva azul completa. Mida la intensidad de iluminación del proyector utilizando un medidor de potencia óptico colocando el cabezal del fotodetector en el techo de la incubadora y leyendo la intensidad en el medidor de potencia correspondiente calibrado a la longitud de onda de luz de 460 nanómetros.
A continuación, ajuste la intensidad de la iluminación mediante un filtro de densidad neutra ajustable situado en la apertura del proyector. Gire el filtro para ajustar la intensidad de iluminación medida por el medidor de potencia hasta que la intensidad de iluminación en el centro de la región proyectada de luz azul lea 50 microvatios por centímetro cuadrado. Es importante asegurarse de que la intensidad de la iluminación se ajusta a un nivel adecuado utilizando el fotodetector calibrado situado en el techo de la incubadora.
Esto permite ajustar con precisión la intensidad de la iluminación girando el filtro de densidad neutra. Ahora dibuje patrones arbitrarios utilizando el software del proyector de presentación en el portátil, y muestre estos patrones en el techo de la incubadora, utilizando el proyector. Antes de la iluminación, raya una cepa pDawn-Ag43 de la población de glicerol en una placa de agar LB-plus-spec.
Permita que las colonias crezcan durante la noche a 37 grados centígrados. Inocular una colonia de bacterias pDawn-Ag43 a partir de una placa de agar en caldo LB-plus-spec, y hacer crecer el cultivo durante la noche hasta la fase estacionaria en una incubadora de temblores a 250 rpm y 37 grados centígrados. Al día siguiente, subdiple el cultivo en una proporción de uno a 1.000 en caldo LB con espectinomicina.
Permita que el cultivo subardiado crezca en una incubadora de temblores a las seis horas a 250 rpm y 37 grados centígrados hasta la fase estacionaria exponencial tardía. Es importante volver a diluir el cultivo nocturno y crecer hasta la fase exponencial tardía antes de la iluminación. Esto garantiza que las bacterias estén confiablemente sanas y activas tras la inducción.
Después de la incubación, subdiple el cultivo de fase exponencial tardía en una proporción de uno a 100 con medios M63 previamente preparados complementados con espectromicina de 50 microgramos por mililitro. A continuación, introduzca la dilución en un plato de cultivo de biopelícula. Como las muestras ya están listas para la iluminación, pegue el plato de cultivo en el techo de la incubadora, asegurando que la superficie en la parte inferior del plato sea transparente para la iluminación desde abajo por el proyector.
Después del crecimiento nocturno de las muestras de biopelícula, retire el plato de cultivo de la incubadora. El plato tendrá bacterias biopelículas unidas a su superficie inferior donde se ha iluminado, así como bacterias planctónicas dispersas en los medios líquidos de arriba. Deseche las células planctónicas eliminando los medios líquidos del plato de cultivo.
A continuación, enjuague la muestra dos veces con PBS para eliminar las células planctónicas restantes pipeteando suavemente en PBS, seguido de aspiración. Si las células están etiquetadas fluorescentemente, imagine directamente las muestras utilizando microscopía de fluorescencia. Como se ve aquí, las bacterias pDawn-Ag43 se utilizaron para generar biopelículas modeladas en placas de pozos de poliestireno con iluminación de proyector.
Las biopelículas se pueden visualizar utilizando tinción violeta cristalina o, alternativamente, a través de microscopía de fluorescencia si se utilizan bacterias fluorescentes. Las muestras de biopelículas fluorescentes también se pueden tomar imágenes mediante microscopía confocal para obtener imágenes del biofilm en 3D. El patrón de alta resolución es posible mediante el uso de una máscara fotográfica de película para proporcionar iluminación con patrones a la muestra de biopelícula.
Aquí se muestran ejemplos de patrones en superficies de vidrio y PDMS, así como cámaras de referencia cultural PDMS cerradas, que ilustran los diferentes tipos de entornos en los que se puede aplicar el patrón pDawn-Ag43. Al intentar este procedimiento, es importante transformar primero pDawn-Ag43 en su cepa de interés, luego enfocar y calibrar correctamente su proyector, y finalmente seguir los pasos de cultivo y de posterior dilución necesarios para preparar sus bacterias para la iluminación. Siguiendo este método, se pueden implementar otras técnicas, por ejemplo, la supervisión de biopelícula a largo plazo bajo diferentes condiciones de cultivo.
De esa manera, podemos entender cómo una estructura de biopelícula afecta a su función. Esta técnica será ampliamente aplicable, por ejemplo, para la investigación de materiales y biología sintética, para diseñar biopelículas hacia diversas aplicaciones.
