Abbiamo sviluppato un metodo chiamato litografia biofilm per far brillare la luce su una superficie, e i batteri si accumulano dove si trova la luce. Questo metodo ci permetterà di rispondere a una domanda chiave nella ricerca sul biofilm, ad esempio, come le strutture spaziali influenzano le funzioni della comunità. Ci sono molti vantaggi in questo metodo.
Ad esempio, funziona ad altissima risoluzione di 25 micrometri, non richiede pre-patterning superficiale e funziona anche all'interno di dispositivi fluidici chiusi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla relazione struttura-funzione dei biofilm naturali, può anche essere applicato ad altre discipline, come l'ingegneria dei biofilm, i biomateriali e la biologia sintetica multicellulare. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto esistono passaggi preliminari chiave per preparare la configurazione della coltura ottica e il campione batterico prima della creazione di biofilm.
In primo luogo, trasformare il plasmide pDawn-Ag43 nel ceppo di interesse E.coli e la piastra su una piastra di agar LB integrata con spectinomicina. Inoculare una singola colonia in brodo LB con spectinomicina in un tubo di coltura, e farla crescere fino a fase esponenziale in un incubatore di scuotimento a 250 giri/min e 37 gradi Celsius. Dopo l'inoculazione, preparare uno stock di glicerolo al 25% del ceppo trasformato pDawn-Ag43 mescolando un millilitro di glicerolo sterile al 50% con un millilitro di coltura in un criotubo.
Conservare il magazzino in un congelatore a meno 80 gradi Celsius. Successivamente, iniziare a preparare la configurazione ottica posizionando un proiettore portatile nella parte inferiore di un incubatore batterico con l'apertura rivolta direttamente verso l'alto verso il soffitto, dove verrà attaccata la camera di coltura del biofilm. Collegare un laptop tramite il cavo di visualizzazione al proiettore all'interno dell'incubatore.
Utilizzare il nastro adesivo per attaccare un piatto di coltura fittizia vuoto al soffitto dell'incubatore. Regolare la messa a fuoco sul proiettore ruotando la manopola di messa a fuoco in modo che il piano di messa a fuoco coincida con la superficie inferiore del piatto di coltura del biofilm attaccato al soffitto dell'incubatore. Il proiettore dovrebbe illuminare un'immagine nitida e non sfocata sul fondo del piatto della coltura.
Rimuovere il piatto di coltura fittizia una volta ottimizzata la proiezione. Utilizzando il software per laptop, dirigere il proiettore per illuminare l'intero campo visivo con la massima illuminazione blu presentando una diapositiva blu completo. Misurare l'intensità di illuminazione del proiettore utilizzando un misuratore di potenza ottico posizionando la testa del fotodetetico al soffitto dell'incubatore e leggendo l'intensità sul misuratore di potenza corrispondente calibrato sulla lunghezza d'onda della luce di 460 nanometri.
Quindi, regolare l'intensità dell'illuminazione utilizzando un filtro a densità neutra regolabile posizionato all'apertura del proiettore. Ruotare il filtro per regolare l'intensità di illuminazione misurata dal misuratore di potenza fino a quando l'intensità dell'illuminazione al centro della regione proiettata a luce blu legge 50 microwatt per centimetro al quadrato. È importante assicurarsi che l'intensità dell'illuminazione sia impostata a un livello adeguato utilizzando il fotodetetico calibrato posizionato sul soffitto dell'incubatore.
Ciò consente un'accurata sintonizzazione dell'intensità dell'illuminazione ruotando il filtro a densità neutra. Ora disegna modelli arbitrari usando il software del proiettore di presentazione sul laptop e visualizza questi modelli sul soffitto dell'incubatore, usando il proiettore. Prima dell'illuminazione, striare un ceppo pDawn-Ag43 dal materiale glicerolo su una piastra di agar LB-plus-spec.
Lascia che le colonie crescano durante la notte a 37 gradi Celsius. Inoculare una colonia di batteri pDawn-Ag43 da una piastra di agar in brodo LB-plus-spec e far crescere la coltura durante la notte fino alla fase stazionaria in un'incubatrice tremante a 250 giri/min e 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, subdiluire la coltura con un rapporto di uno a 1.000 in brodo LB con spectinomicina.
Lasciare crescere la cultura sottodiluta in un incubatore di scuotimenti a sei ore a 250 giri/min e 37 gradi Celsius fino alla fase esponenziale tardiva e stazionaria precoce. È importante diluire la cultura notturna e crescere fino alla fase esponenziale tardiva prima dell'illuminazione. Ciò garantisce che i batteri siano sani e attivi in modo affidabile all'induzione.
Dopo l'incubazione, subdiluire la coltura in fase tardo-esponenziale con un rapporto di uno a 100 con supporti M63 precedentemente preparati integrati con 50 microgrammi per millilitro spectinomicina. Quindi, introdurre la diluizione in un piatto di cultura del biofilm. Poiché i campioni sono ora pronti per l'illuminazione, rastrepare il piatto di coltura sul soffitto dell'incubatore, assicurando che la superficie nella parte inferiore del piatto sia trasparente per l'illuminazione dal basso da parte del proiettore.
Dopo la crescita notturna dei campioni di biofilm, rimuovere il piatto di coltura dall'incubatore. Il piatto avrà batteri biofilm attaccati alla sua superficie inferiore dove è stato illuminato, così come batteri planctonici dispersi nei mezzi liquidi sopra. Scartare le cellule planctoniche rimuovendo il supporto liquido dal piatto di coltura.
Successivamente, sciacquare il campione due volte con PBS per rimuovere le restanti cellule planctoniche con pipettando delicatamente in PBS, seguito dall'aspirazione. Se le cellule sono contrassegnate fluorescentmente, immagini direttamente i campioni utilizzando la microscopia a fluorescenza. Come si vede qui, i batteri pDawn-Ag43 sono stati utilizzati per generare biofilm modellati in piastre di polistirolo con illuminazione del proiettore.
I biofilm possono essere visualizzati utilizzando la colorazione viola cristallo o in alternativa attraverso la microscopia a fluorescenza se si utilizzano batteri fluorescenti. Campioni di biofilm fluorescenti possono anche essere immagini utilizzando la microscopia confocale per ottenere immagini del biofilm in 3D. La creazione di modelli ad alta risoluzione è possibile utilizzando una maschera fotografica per fornire un'illuminazione a motivi geometrici al campione di biofilm.
Esempi di modelli su superfici in vetro e PDMS, nonché camere di coltura PDMS chiuse, sono mostrati qui e illustrano i diversi tipi di ambienti in cui è possibile applicare la modellizzazione pDawn-Ag43. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prima trasformare pDawn-Ag43 nel ceppo di interesse, quindi mettere correttamente a fuoco e calibrare il proiettore e infine seguire le impostazioni cultura e i passaggi di diluizione posteriore necessari per preparare i batteri all'illuminazione. Seguendo questo metodo, è possibile utilizzare altre tecniche, ad esempio il monitoraggio del biofilm a lungo termine in diverse condizioni culturali.
In questo modo, possiamo capire come una struttura di biofilm influenzi la sua funzione. Questa tecnica sarà ampiamente applicabile, ad esempio, per la biologia sintetica e la ricerca sui materiali, per progettare biofilm verso varie applicazioni.
