Desenvolvemos um método chamado litografia biofilm para iluminar uma superfície, e as bactérias se acumulam onde a luz está. Esse método nos permitirá responder a perguntas-chave na pesquisa de biofilmes, por exemplo, como as estruturas espaciais afetam as funções da comunidade. Há muitas vantagens nesse método.
Por exemplo, ele funciona com uma resolução muito alta de 25 micrômetros, não requer pré-padronização superficial, e também funciona dentro de dispositivos fluidos fechados. Embora este método possa fornecer insights sobre a relação estrutura-função de biofilmes naturais, ele também pode ser aplicado a outras disciplinas, como engenharia de biofilmes, biomateriais e biologia sintética multicelular. A demonstração visual deste método é fundamental, pois existem etapas preliminares fundamentais para preparar a configuração da cultura óptica e a amostra bacteriana antes da padronização do biofilme.
Primeiro, transforme o plasmídeo pDawn-Ag43 na cepa de interesse E.coli, e coloque uma placa de ágar LB complementada com espectincina. Inocular uma única colônia em caldo LB com espectincina em um tubo de cultura, e cultivá-la em fase exponencial em uma incubadora de agitação a 250 rpm e 37 graus Celsius. Após a inoculação, prepare um estoque de 25% de glicerol da cepa transformada pDawn-Ag43 misturando um mililitro de glicerol 50% estéril com um mililitro de cultura em um crio-tubo.
Armazene o estoque em um freezer Celsius de menos 80 graus. Em seguida, comece a preparar a configuração óptica colocando um projetor portátil na parte inferior de uma incubadora bacteriana com a abertura apontando diretamente para cima no teto, onde a câmara de cultura de biofilm será anexada. Conecte um laptop através do cabo de exibição ao projetor dentro da incubadora.
Use fita adesiva para anexar um prato de cultura manequim vazio ao teto da incubadora. Ajuste o foco no projetor girando o botão de foco para que o plano focalizante coincida com a superfície inferior do prato de cultura de biofilme preso ao teto da incubadora. O projetor deve iluminar uma imagem nítida e não embaçada na parte inferior do prato de cultura.
Remova o prato de cultura manequim uma vez que a projeção tenha sido otimizada. Usando o software do laptop, direcione o projetor para iluminar todo o campo de visão com máxima iluminação azul, apresentando um slide azul completo. Meça a intensidade de iluminação do projetor usando um medidor óptico de potência colocando a cabeça fotodetector no teto da incubadora e lendo a intensidade no medidor de energia correspondente calibrado para comprimento de onda leve de 460 nanômetros.
Em seguida, ajuste a intensidade de iluminação usando um filtro de densidade neutra ajustável colocado na abertura do projetor. Gire o filtro para ajustar a intensidade de iluminação medida pelo medidor de energia até que a intensidade de iluminação no centro da região projetada de luz azul leia 50 microwatts por centímetro ao quadrado. É importante garantir que a intensidade de iluminação seja definida em um nível adequado usando o fotodetector calibrado posicionado no teto da incubadora.
Isso permite um ajuste preciso da intensidade de iluminação girando o filtro de densidade neutra. Agora desenhe padrões arbitrários usando o software do projetor de apresentação no laptop, e exiba esses padrões no teto da incubadora, usando o projetor. Antes da iluminação, coloque uma cepa pDawn-Ag43 do estoque de glicerol em uma placa de ágar LB-plus-spec.
Permita que as colônias cresçam durante a noite a 37 graus Celsius. Inocular uma colônia de bactérias pDawn-Ag43 a partir de uma placa de ágar em caldo LB-plus-spec, e crescer a cultura durante a noite para a fase estacionária em uma incubadora de agitação a 250 rpm e 37 graus Celsius. No dia seguinte, subdilute a cultura em uma proporção de um a 1.000 em caldo LB com espectincina.
Permita que a cultura subdiluda cresça em uma incubadora de agitação a seis horas a 250 rpm e 37 graus Celsius até o final da fase estacionária, no início. É importante diluir a cultura da noite para o dia e crescer até a fase exponencial tardia antes da iluminação. Isso garante que as bactérias sejam confiáveis e ativas após a indução.
Após a incubação, subdilute a cultura de fase exponencial tardia em uma proporção de 1 a 100 com mídia M63 previamente preparada complementada com 50 microgramas por mililitros de espectincina. Em seguida, introduzir a diluição em um prato de cultura biofilm. Como as amostras estão agora prontas para iluminação, tape o prato de cultura no teto da incubadora, garantindo que a superfície na parte inferior do prato seja transparente para iluminação abaixo pelo projetor.
Após o crescimento durante a noite das amostras de biofilme, remova o prato de cultura da incubadora. O prato terá bactérias biofilmes presas à sua superfície inferior onde foi iluminada, bem como bactérias planctônicas dispersas na mídia líquida acima. Descarte as células planctônicas removendo a mídia líquida do prato de cultura.
Em seguida, enxágüe a amostra duas vezes com PBS para remover as células planctônicas restantes, tubos suavemente em PBS, seguido de aspiração. Se as células estiverem marcadas fluorescentemente, a imagem direta das amostras usando microscopia de fluorescência. Como visto aqui, as bactérias pDawn-Ag43 foram usadas para gerar biofilmes padronizados em placas de poços de poliestireno com iluminação do projetor.
Os biofilmes podem ser visualizados usando manchas violetas cristalinas ou, alternativamente, através de microscopia de fluorescência se usar bactérias fluorescentes. Amostras de biofilme fluorescente também podem ser imagens usando microscopia confocal para obter imagens do biofilme em 3D. A padronização de alta resolução é possível usando uma máscara fotográfica de filme para fornecer iluminação padronizada à amostra de biofilme.
Exemplos de padronização em superfícies de vidro e PDMS, bem como câmaras de cultura PDMS fechadas, são mostrados aqui e ilustram os diferentes tipos de ambientes onde a padronização pDawn-Ag43 pode ser aplicada. Ao tentar este procedimento, é importante primeiro transformar pDawn-Ag43 em sua variedade de interesse, em seguida, concentrar e calibrar adequadamente seu projetor, e finalmente seguir a cultura necessária e passos de diluição para preparar suas bactérias para iluminação. Seguindo esse método, outras técnicas podem ser implantadas, por exemplo, monitorando o biofilme a longo prazo em diferentes condições culturais.
Dessa forma, podemos entender como uma estrutura de biofilm afeta sua função. Essa técnica será amplamente aplicável, por exemplo, para a biologia sintética e pesquisa de materiais, para projetar biofilmes para diversas aplicações.
