표면에 빛을 비추기 위해 생물막 리소그래피라는 방법을 개발하였고, 박테리아는 빛이 있는 곳에 축적되었습니다. 이 방법을 사용하면 생물막 연구의 핵심 질문에 대답할 수 있습니다(예: 공간 구조가 지역 사회 기능에 미치는 영향). 이 방법에는 많은 장점이 있습니다.
예를 들어, 25 마이크로미터의 매우 높은 해상도에서 작동하며 표면 사전 패터닝이 필요하지 않으며 폐쇄 된 유체 장치 내부에서도 작동합니다. 이 방법은 천연 생물막의 구조 기능 관계에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 생물 막 공학, 생물 재료 및 다세포 합성 생물학과 같은 다른 분야에도 적용 할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 데모는 생물막 패터닝 전에 광학 배양 설정 및 세균 샘플을 준비하는 주요 예비 단계가 있기 때문에 중요합니다.
먼저 pDawn-Ag43 플라스미드를 E.coli 스트레인으로 변환하고, 스펙티노마이신으로 보충된 LB 한천 판에 플레이트를 넣습니다. 문화 관에 스펙티노마이신으로 LB 국물에 단일 식민지를 접종하고, 250 rpm과 섭씨 37도에서 흔들리는 인큐베이터에서 기하급수적 단계로 성장한다. 접종 후, 냉동튜브에 1밀리리터의 50%의 멸균 글리세롤 1밀리리터를 혼합하여 변형된 균주의 25%의 글리세롤 스톡을 제조한다.
재고를 영하 80도 의 냉동고에 보관하십시오. 다음으로, 생체막 배양챔버가 부착될 천장을 직접 위쪽으로 가리키는 조리개와 함께 세균 인큐베이터 의 바닥에 휴대용 프로젝터를 배치하여 광학 설정 준비를 시작합니다. 디스플레이 케이블을 통해 랩톱을 인큐베이터 내부의 프로젝터에 연결합니다.
테이프를 사용하여 빈 더미 문화 접시를 인큐베이터의 천장에 부착하십시오. 초점 평면이 인큐베이터의 천장에 부착된 생물막 배양 접시의 바닥 표면과 일치하도록 초점 노브를 돌려 프로젝터에 초점을 조정합니다. 프로젝터는 문화 접시의 바닥에 선명하고 흐릿하지 않은 이미지를 비춰야 합니다.
투영이 최적화되면 더미 문화 접시를 제거합니다. 랩톱 소프트웨어를 사용하여 프로젝터를 지시하여 전체 파란색 슬라이드를 표시하여 최대 파란색 조명으로 전체 시야를 비춥니다. 광검출기 헤드를 인큐베이터 천장에 배치하고 460 나노미터의 광파장으로 보정된 해당 전력 미터의 강도를 판독하여 광학 전력 계를 사용하여 프로젝터의 조명 강도를 측정합니다.
다음으로 프로젝터 조리개에 배치된 조절 가능한 중립 밀도 필터를 사용하여 조명 강도를 조정합니다. 필터를 회전하여 청색광 투영 영역의 중앙에 있는 조명 강도가 50 마이크로와트/제곱미터를 판독할 때까지 파워 미터에 의해 측정된 조명 강도를 조정합니다. 인큐베이터 천장에 위치한 보정된 광검출기를 사용하여 조명 강도가 적절한 수준으로 설정되도록 하는 것이 중요합니다.
이를 통해 중립 밀도 필터를 회전하여 조명 강도의 정확한 튜닝을 할 수 있습니다. 이제 랩톱의 프레젠테이션 프로젝터 소프트웨어를 사용하여 임의패턴을 그리고 프로젝터를 사용하여 인큐베이터 천장에 이러한 패턴을 표시합니다. 조명 전에, LB 플러스 사양 한마접시에 글리세롤 주식에서 pDawn-Ag43 균주를 줄이.
식민지가 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 자랄 수 있도록 하십시오. LB 플러스 스펙 국물에 있는 한천판에서 pDawn-Ag43 박테리아의 식민지를 접종하고, 250 rpm및 섭씨 37도에서 흔들리는 인큐베이터에서 고정 된 단계로 하룻밤 문화를 성장시다. 다음 날, 스펙티노마이신과 함께 LB 국물에 1 대 1, 000의 비율로 문화를 희석.
희석된 배양은 250rpm에서 6시간, 후기 지수, 초기 고정 단계까지 섭씨 37도에서 흔들리는 인큐베이터에서 성장할 수 있도록 합니다. 하룻밤 문화를 다시 희석하고 조명 전에 늦은 기하급수적인 단계로 성장하는 것이 중요합니다. 이것은 박테리아가 유도시 안정적으로 건강하고 활성화되도록 합니다.
인큐베이션에 이어, 이전에 준비된 M63 배지를 밀리리터 당 50마이크로그램으로 보충하여 1대 100의 비율로 후기 지수상 배양을 희석시켰다. 그런 다음, 바이오 필름 문화 접시에 희석을 소개합니다. 샘플이 이제 조명을 받을 준비가 되었으므로 배양 접시를 인큐베이터 천장에 테이프로 표시하여 접시 바닥의 표면이 프로젝터에 의해 아래에서 조명을 투명하게 만들 수 있도록 합니다.
생물막 샘플의 하룻밤 성장 후, 인큐베이터에서 배양 접시를 제거합니다. 접시는 발광 된 바닥 표면에 부착 된 생물 막 박테리아뿐만 아니라 위의 액체 매체에 분산 된 판자 박테리아를 해야합니다. 배양 접시에서 액체 매체를 제거하여 판자 세포를 폐기하십시오.
다음으로, PBS로 샘플을 두 번 헹구어 PBS에서 부드럽게 파이펫팅하여 나머지 판자 세포를 제거하고 포부가 뒤따릅니다. 세포가 형광 태그인 경우 형광 현미경 검사를 사용하여 샘플을 직접 이미지화합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, pDawn-Ag43 박테리아는 프로젝터 조명이 있는 폴리스티렌 웰 플레이트에 패턴화된 생물필름을 생성하는 데 사용되었습니다.
생물막은 형광균을 사용하는 경우 크리스탈 바이올렛 염색 또는 형광 현미경 검사를 통해 시각화될 수 있다. 형광 생물막 샘플은 또한 공초점 현미경 을 사용하여 3D에서 생물막의 이미지를 얻기 위하여 심화될 수 있습니다. 필름 포토마스크를 사용하여 생물막 시료에 패턴 조명을 제공함으로써 고해상도 패터닝이 가능합니다.
유리 및 PDMS 표면의 패킹 예는 동봉된 PDMS 배양 챔버뿐만 아니라 여기에 표시되며 pDawn-Ag43 패터닝이 적용 될 수있는 다양한 유형의 환경을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안, 먼저 관심의 변형으로 pDawn-Ag43을 변환 한 다음 적절하게 초점을 맞추고 프로젝터를 보정하고 마지막으로 조명에 대한 박테리아를 준비하기 위해 필요한 문화 및 백 희석 단계를 따르는 것이 중요합니다. 이 방법에 따라 다른 기술을 배포할 수 있습니다(예: 상이한 문화 조건 하에서 생물막을 장기적으로 모니터링하는 경우).
이렇게 하면 생물막 구조가 그 기능에 미치는 영향을 이해할 수 있습니다. 이 기술은 합성 생물학 및 재료 연구에 널리 적용될 것이며, 예를 들어 생물막을 다양한 응용 분야로 설계할 수 있습니다.
