表面に光を当てるバイオフィルムリソグラフィーという手法を開発し、その場所に細菌が蓄積します。この方法は、空間構造がコミュニティ機能にどのような影響を与えるかなど、バイオフィルム研究における重要な質問に答えることを可能にします。この方法には多くの利点があります。
例えば、それは25マイクロメートルの非常に高い決断で働き、表面の前パターニングを必要とせず、また閉鎖された流体装置の内部で働く。この方法は、天然バイオフィルムの構造機能関係に関する洞察を提供することができますが、バイオフィルム工学、バイオマテリアル、多細胞合成生物学などの他の分野にも応用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、バイオフィルムパターニングの前に光学培養のセットアップと細菌サンプルを準備するための重要な予備的なステップがあるので重要です。
まず、pDawn-Ag43プラスミドを目的の大腸菌株に変換し、スペチノマイシンを補充したLB寒天プレートにプレートします。培養管内のスペクトルマイシンを含むLBスープに単一コロニーを接種し、250rpmおよび摂氏37度の揺れインキュベーターで指数相に成長させる。接種後、50%無菌グリセロールの1ミリリットルを1ミリリットルの培養物と共にクライオチューブに混合してpDawn-Ag43形質転換株の25%グリセロールストックを調製する。
在庫をマイナス80°Cの冷凍庫に保管してください。次に、開口が天井を真上に向け、バイオフィルム培養チャンバーが取り付けられる細菌インキュベーターの底部にポータブルプロジェクターを配置して、光学セットアップの準備を始めます。ディスプレイケーブルでラップトップをインキュベーター内のプロジェクタに接続します。
テープを使用して、空のダミー培養皿をインキュベーターの天井に取り付けます。焦点を合わせる平面がインキュベーターの天井に取り付けられたバイオフィルム培養皿の底面と一致するように焦点を合わせると、プロジェクタの焦点を調整します。プロジェクターは、文化皿の底に鋭く、ぼやけていない画像を照らす必要があります。
投影が最適化されたら、ダミーの培養皿を取り除きます。ラップトップソフトウェアを使用して、プロジェクターにフルブルーのスライドを提示することで、最大の青色の照明で完全視野を照らすように指示します。光検出器ヘッドをインキュベーター天井に配置し、460ナノメートルの光波長にキャリブレーションされた対応するパワーメーターの強度を読み取ることによって、光パワーメーターを使用してプロジェクタの照明強度を測定します。
次に、プロジェクター絞りに配置された調整可能な中立密度フィルタを使用して、照明強度を調整します。フィルターを回転させて、青色光投影領域の中央の照明強度が 50 マイクロワット/メートル平方になるまで、パワーメーターで測定した照明強度を調整します。インキュベーター天井に位置するキャリブレーションされた光検出器を使用して、照明強度が適切なレベルに設定されていることを確認することが重要です。
これは中立密度フィルターを回すことによって照明の強度の正確な調整を可能にする。今、ラップトップ上のプレゼンテーションプロジェクターソフトウェアを使用して任意のパターンを描き、プロジェクターを使用して、インキュベーターの天井にこれらのパターンを表示します。照明の前に、グリセロールストックからLBプラス仕様の寒天板にpDawn-Ag43株をストリークします。
コロニーは摂氏37度で一晩成長することができます。LBプラススペックブロスの寒天プレートからpDawn-Ag43細菌のコロニーを接種し、250rpmと摂氏37度で振盪インキュベーターで一晩定在相に培養を成長させます。翌日、スペクトルを用いたLBブロスで1~1,000の割合で培養を薄く希釈する。
250 rpm で 6 時間、摂氏 37 度で、後期指数、早期定常相まで、希釈後の培養液を揺れ培養します。夜間培養をバック希釈し、照明前に後期指数位相に成長することが重要です。これにより、細菌は確実に健康で、誘導時に活性を確保します。
インキュベーションに続いて、前に調製したM63培地に50マイクログラム/ミリリットルスペチノマイシンを加えた1〜100の比率で後期指数相培養を希釈する。次に、バイオフィルム培養皿に希釈を導入する。サンプルが照明の準備が整ったので、培養皿をインキュベーターの天井にテープで貼り付け、皿の底面がプロジェクタによって下から照光されるようにします。
バイオフィルムサンプルの一晩の成長後、培養器から培養皿を取り除く。この皿は、照明された下面にバイオフィルム細菌が取り付けられ、上記の液体培地に分散したプランクトニック細菌が付着する。培養皿から液体培地を取り除いてプランクトニック細胞を捨てます。
次に、PBSでサンプルを2回リンスし、PBS中で軽くピペット処理して残りのプランクトン細胞を除去し、続いて吸引を行う。細胞が蛍光的にタグ付けされている場合は、蛍光顕微鏡を使用してサンプルを直接画像化します。ここで見られるように、pDawn-Ag43細菌は、プロジェクタ照明を備えたポリスチレンウェルプレートにパターン化されたバイオフィルムを生成するために使用された。
バイオフィルムは、蛍光細菌を使用する場合は、結晶紫色染色を使用して、または蛍光顕微鏡を介して別の方法で可視化することができます。蛍光バイオフィルムサンプルは、共焦点顕微鏡を用いて、バイオフィルムの画像を3Dで得ることもできます。高解像パターン化は、フィルムフォトマスクを用いて、バイオフィルムサンプルにパターン化された照明を提供することで可能である。
ガラスおよびPDMS表面上のパターニングの例は、封入されたPDMS培養チャンバーと同様に、ここに示され、pDawn-Ag43パターニングを適用できる異なるタイプの環境を示す。この手順を試みる間、最初にpDawn-Ag43を目的の株に変換し、プロジェクターに適切に焦点を合わせてキャリブレーションし、最後に必要な培養とバック希釈手順に従って細菌を照明に備えることを重要です。この方法に従って、他の技術、例えば、異なる培養条件下でのバイオフィルムの長期モニタリングを展開することができる。
そうすれば、バイオフィルム構造がその機能にどのような影響を与えるかを理解することができます。この技術は、合成生物学や材料研究など、バイオフィルムを様々な用途に向けて設計するために広く応用できる。
