Мы разработали метод под названием биопленка литографии, чтобы светить свет на поверхность, и бактерии накапливаются там, где свет. Этот метод позволит нам ответить на ключевой вопрос в исследованиях биопленки, например, как пространственные структуры влияют на функции сообщества. Этот метод имеет много преимуществ.
Например, он работает с очень высоким разрешением 25 микрометров, не требует предварительной картины поверхности, а также работает внутри закрытых жидкостных устройств. Хотя этот метод может дать представление о структуре-функции отношения природных биопленок, он также может быть применен к другим дисциплинам, таким как биопленка инженерии, биоматериалы, и многоклеточной синтетической биологии. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку существуют ключевые предварительные шаги по подготовке оптической установки культуры и бактериального образца до биопленки шаблона.
Во-первых, превратить pDawn-Ag43 плазмид в штамм E.coli интерес, и пластины на пластину LB агар дополнены спектромицин. Привить одну колонию в бульон LB с спектромицином в трубке культуры, и вырастить его до экспоненциальной фазы в трясущимся инкубаторе при 250 об/мин и 37 градусов по Цельсию. После прививки, подготовить 25%глицерол запас pDawn-Ag43 преобразован штамма путем смешивания одного миллилитра 50%стерильный глицерол с одним миллилитр культуры в крио-трубке.
Храните бульон в морозильной камере до минус 80 градусов по Цельсию. Далее начните подготовку оптической установки путем размещения портативного проектора в нижней части бактериального инкубатора с диафрагмой, указывающей прямо вверх на потолок, где будет прикреплена камера культуры биопленки. Подключите ноутбук через дисплей кабеля к проектору внутри инкубатора.
Используйте ленту, чтобы прикрепить пустое блюдо культуры манекен к потолку инкубатора. Отрегулируйте фокус на проекторе, повернув фокусированную ручку так, чтобы фокусировка плоскости совпадала с нижней поверхностью блюда культуры биопленки, прикрепленного к потолку инкубатора. Проектор должен осветить резкое, не размытое изображение на дно культурного блюда.
Удалите манекен культуры блюдо после того, как проекция была оптимизирована. Используя программное обеспечение ноутбука, направьте проектор, чтобы осветить полное поле зрения с максимальным синим освещением, представляя полный синий слайд. Измерьте интенсивность освещения проектора с помощью оптического счетчика мощности, поместив голову фотодетектора на потолок инкубатора и читая интенсивность соответствующего счетчика мощности, откалиброванного до световой длины волны 460 нанометров.
Затем отрегулируйте интенсивность освещения с помощью регулируемого фильтра нейтральной плотности, размещенного в диафрагме проектора. Поверните фильтр, чтобы регулировать интенсивность освещения, измеряемую счетчиком мощности, до тех пор, пока интенсивность освещения в центре области, проецируемой синим светом, не будет считывает 50 микроватт на сантиметр в квадрате. Важно обеспечить, чтобы интенсивность освещения была установлена на должном уровне с помощью откалиброванного фотодетектора, расположенного на потолке инкубатора.
Это позволяет точно настроить интенсивность освещения путем вращения фильтра нейтральной плотности. Теперь нарисуйте произвольные шаблоны с помощью программного обеспечения презентации проектора на ноутбуке, и отобразить эти шаблоны на потолке инкубатора, используя проектор. Перед освещением, полоса pDawn-Ag43 штамм из глицерола фонда на LB-плюс-спец агар пластины.
Разрешить колоний расти в одночасье при 37 градусов по Цельсию. Прививка колонии pDawn-Ag43 бактерий из агар пластины в LB-плюс-спец бульон, и расти культуры ночь на стационарной фазе в трясущимся инкубатором на 250 об / мин и 37 градусов по Цельсию. На следующий день, подширить культуру в соотношении от одного до 1000 в бульоне LB со спектромицином.
Разрешить субразбавленной культуры расти в трясущимся инкубаторе в шесть часов при 250 об / мин и 37 градусов по Цельсию до конца экспоненциальной, ранней стационарной фазы. Важно, чтобы обратно разбавить ночь культуры и расти до поздней экспоненциальной фазы до освещения. Это гарантирует, что бактерии надежно здоровы и активны после индукции.
После инкубации, subdilute поздней экспоненциальной фазы культуры в соотношении от одного до 100 с ранее подготовленных M63 средств массовой информации дополняется 50-микрограмм на миллилитр спектромицин. Затем ввимите разбавление в блюдо культуры биопленки. Поскольку образцы теперь готовы к освещению, лента культуры блюдо к потолку инкубатора, гарантируя, что поверхность в нижней части блюда является прозрачной для освещения снизу проектором.
После ночного роста образцов биопленки удалите блюдо культуры из инкубатора. Блюдо будет иметь биопленоплено бактерий, прикрепленных к его нижней поверхности, где она была освещена, а также планктонных бактерий, рассеянных в жидком смирее выше. Откажитесь от планктонных клеток, удалив жидкие средства из культуры блюдо.
Затем, промыть образец два раза с PBS, чтобы удалить оставшиеся планктонные клетки, мягко трубопроводов в PBS, а затем стремление. Если клетки флуоресцентно помечены, непосредственно изображение образцов с помощью флуоресценции микроскопии. Как видно здесь, бактерии pDawn-Ag43 использовались для создания биопленок, узорчатых в полистирола хорошо пластин с проектором освещения.
Биопленки можно визуализировать с помощью кристально фиолетового окрашивания или в качестве альтернативы с помощью флуоресцентной микроскопии при использовании флуоресцентных бактерий. Флуоресцентные образцы биопленки также могут быть изображены с помощью конфокалиптерной микроскопии для получения изображений биопленки в 3D. Узор с высоким разрешением возможен с помощью фотомаска пленки для обеспечения узорчатого освещения образца биопленки.
Примеры узора на стеклянных и PDMS поверхностях, а также закрытые камеры культуры PDMS, показаны здесь и иллюстрируют различные типы сред, где pDawn-Ag43 шаблон может быть применен. При попытке этой процедуры, важно сначала превратить pDawn-Ag43 в ваш штамм интереса, а затем правильно сосредоточиться и откалибровать проектор, и, наконец, следовать требуемой культуры и обратно разбавления шаги для подготовки бактерий для освещения. Следуя этому методу, могут быть развернуты другие методы, например, мониторинг биопленки в долгосрочной перспективе в различных культурных условиях.
Таким образом, мы можем понять, как структура биопленки влияет на ее функцию. Этот метод будет широко применяться, например, для синтетической биологии и исследований материалов, для разработки биопленок для различных применений.
