طورنا طريقة تسمى التصوير الحجري البيولوجي لتلميع الضوء على سطح، والبكتيريا تتراكم حيث الضوء. وستتيح لنا هذه الطريقة الإجابة على السؤال الرئيسي في بحوث الأفلام الحيوية، على سبيل المثال، كيف تؤثر الهياكل المكانية على وظائف المجتمع. هناك العديد من المزايا لهذا الأسلوب.
على سبيل المثال، يعمل بدقة عالية جدا من 25 ميكرومتر، فإنه لا يتطلب السطح قبل النقش، ويعمل أيضا داخل الأجهزة المائعة مغلقة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة العلاقة بين الهيكل والوظائف من الأغشية الحيوية الطبيعية، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على التخصصات الأخرى، مثل الهندسة الحيوية، والمواد الحيوية، والبيولوجيا الاصطناعية متعددة الخلايا. إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حيث أن هناك خطوات أولية رئيسية لإعداد إعداد الثقافة البصرية وعينة بكتيرية قبل نقش الغشاء الحيوي.
أولاً، تحويل pDawn-Ag43 plasmid إلى سلالة الإشريكية القولونية من الفائدة، ولوحة على لوحة LB agar تكملها سبكتينوميسين. تلقيح مستعمرة واحدة في مرق LB مع سببتونوميسين في أنبوب الثقافة، وتنمو إلى مرحلة أسية في حاضنة تهتز في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. بعد التطعيم، وإعداد مخزون 25٪ من الجلسرين من سلالة pDawn-Ag43 تحويلها عن طريق خلط ملليلتر واحد من 50٪ معقمة الجلسرين مع ملليلتر واحد من الثقافة في أنبوب التبريد.
تخزين المخزون في ثلاجة ناقص 80 درجة مئوية. بعد ذلك، ابدأ في إعداد الإعداد البصري عن طريق وضع جهاز عرض محمول في الجزء السفلي من حاضنة بكتيرية مع الإشارة إلى الفتحة مباشرة إلى الأعلى في السقف، حيث سيتم إرفاق غرفة ثقافة بيو فيلم. قم بتوصيل جهاز كمبيوتر محمول عبر كابل العرض بجهاز العرض داخل الحاضنة.
استخدم الشريط لإرفاق طبق ثقافة وهمية فارغة إلى سقف الحاضنة. ضبط التركيز على جهاز العرض عن طريق تحويل مقبض التركيز بحيث يتزامن مستوى التركيز مع السطح السفلي لطبق ثقافة بيو فيلم المرفق بسقف الحاضنة. يجب أن يضيء جهاز العرض صورة حادة وغير ضبابية على الجزء السفلي من طبق الثقافة.
إزالة طبق ثقافة وهمية مرة واحدة وقد تم تحسين الإسقاط. باستخدام برامج الكمبيوتر المحمول، قم بتوجيه جهاز العرض لإلقاء الضوء على مجال الرؤية الكامل مع أقصى إضاءة زرقاء من خلال تقديم شريحة زرقاء كاملة. قم بقياس شدة الإضاءة لجهاز العرض باستخدام عداد طاقة بصري عن طريق وضع رأس الاضاءة الضوئية في سقف الحاضنة وقراءة الكثافة على عداد الطاقة المطابق معايرة إلى الطول الموجي الخفيف من 460 نانومتر.
بعد ذلك، اضبط شدة الإضاءة باستخدام مرشح الكثافة المحايد القابل للتعديل الموضوع في فتحة العرض. قم بتدوير الفلتر لضبط شدة الإضاءة التي تقاس بمقياس الطاقة حتى تقوم كثافة الإضاءة في وسط المنطقة المسقطة للضوء الأزرق بقراءة 50 ميكروواط لكل سنتيمتر مربع. من المهم ضمان ضبط كثافة الإضاءة على مستوى مناسب باستخدام المُعايرة الضوئية الموضوعة في سقف الحاضنة.
وهذا يسمح توليف دقيق من كثافة الإضاءة من خلال تناوب مرشح الكثافة محايدة. الآن رسم أنماط التعسفي باستخدام برنامج العرض التقديمي على الكمبيوتر المحمول، وعرض هذه الأنماط على سقف الحاضنة، وذلك باستخدام جهاز العرض. قبل الإضاءة، خط سلالة pDawn-Ag43 من مخزون الجلسرين على لوحة أجار LB-plus-spec.
السماح للمستعمرات أن تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تلقيح مستعمرة من البكتيريا pDawn-Ag43 من لوحة أجار في مرق LB-plus-spec، وتنمو الثقافة بين عشية وضحاها إلى مرحلة ثابتة في حاضنة تهتز عند 250 دورة في الدقيقة و37 درجة مئوية. في اليوم التالي، subdilute الثقافة بنسبة 1 إلى 1،000 في مرق LB مع سببتونايسين.
السماح للثقافة المخففة دون أن تنمو في حاضنة تهتز في ست ساعات في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية حتى وقت متأخر من الطور الأسي، في وقت مبكر ثابتة. من المهم أن تعود إلى تخفيف ثقافة بين عشية وضحاها وتنمو إلى مرحلة أسية في وقت متأخر قبل الإضاءة. وهذا يضمن البكتيريا صحية ونشطة بشكل موثوق عند الحث.
بعد الحضانة، subdilute ثقافة في وقت متأخر من الطور الأسي بنسبة واحد إلى 100 مع وسائل الإعلام M63 أعدت سابقا تستكمل مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر spectinomycin. ثم، أدخل التخفيف في طبق ثقافة بيو فيلم. بما أن العينات جاهزة الآن للإضاءة، الشريط طبق الثقافة إلى سقف الحاضنة، وضمان أن السطح في الجزء السفلي من الطبق شفافا للإضاءة من أسفل من قبل جهاز العرض.
بعد نمو بين عشية وضحاها من عينات بيو فيلم، وإزالة طبق الثقافة من الحاضنة. سيكون الطبق بكتيريا بيو فيلم تعلق على سطحه السفلي حيث تم إنارة، فضلا عن البكتيريا العوالق المنتشرة في وسائل الإعلام السائلة أعلاه. تجاهل الخلايا planktonic عن طريق إزالة وسائل الإعلام السائلة من طبق الثقافة.
المقبل، شطف العينة مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا العوالق المتبقية عن طريق الأنابيب بلطف في برنامج تلفزيوني، تليها الطموح. إذا كانت الخلايا الموسومة بالفلورية، صورة مباشرة للعينات باستخدام المجهر الفلوري. كما رأينا هنا، تم استخدام بكتيريا pDawn-Ag43 لتوليد الأغشية الحيوية المنقوشة في صحون بئر البوليسترين مع إضاءة جهاز العرض.
يمكن تصور الأغشية الحيوية باستخدام تلطيخ البنفسج الكريستالي أو بدلاً من ذلك من خلال المجهر الفلوري إذا استخدم البكتيريا الفلورية. ويمكن أيضاً تصوير عينات الفلورسنت البيولوجي باستخدام المجهر الميكروفي للحصول على صور من البيوفيلم ثلاثي الأبعاد. يمكن النقش عالي الدقة باستخدام قناع ضوئي للفيلم لتوفير إضاءة منقوشة لعينة البيوفيلم.
وتظهر هنا أمثلة على النقش على الأسطح الزجاجية وPMS، وكذلك غرف ثقافة PDMS المغلقة، وتوضح أنواع مختلفة من البيئات التي يمكن فيها تطبيق النقش pDawn-Ag43. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أولاً تحويل pDawn-Ag43 إلى إجهاد الاهتمام الخاص بك، ثم التركيز بشكل صحيح ومعايرة جهاز العرض الخاص بك، وأخيراً اتبع الثقافة المطلوبة والخطوات المخففة مرة أخرى لإعداد البكتيريا الخاصة بك للإضاءة. باتباع هذه الطريقة، يمكن نشر تقنيات أخرى، على سبيل المثال، مراقبة البيو فيلم على المدى الطويل في ظل ظروف ثقافية مختلفة.
بهذه الطريقة، يمكننا أن نفهم كيف يؤثر بنية بيو فيلم على وظيفتها. وسوف تكون هذه التقنية قابلة للتطبيق على نطاق واسع، على سبيل المثال، في مجال البيولوجيا التركيبية وبحوث المواد، على هندسة الأغشية الحيوية في مختلف التطبيقات.
