Este protocolo automatizado permite a preparação histopatológica de tecidos murinos com sistemas robóticos rotineiramente utilizados para processamento e incorporação de amostras humanas, aumentando consideravelmente a qualidade das amostras. As principais vantagens dessa técnica, são que ela reduz o número de variáveis metodológicas e melhora a padronização das etapas processuais. Demonstrando o procedimento, será Francesca Boggio.
Francesca Boggio é uma patologista trabalhando no meu laboratório. Comece usando pequenas pinças para transferir as amostras fixas de tecido de cólon murino da formalina tamponada neutra, para uma placa de trabalho de secção em uma placa de Petri. Use um bisturi estéril para cortar o cólon em fragmentos de 0,2 a 0,3 centímetros, e use a pinça para colocar um segmento em cada um dos três pontas de plástico não adjacentes de um orientado para incorporação de parafina.
Empurre cuidadosamente as quatro bordas para fechar o e inserir a grade em uma estrutura de suporte de plástico. Em seguida, rotule o quadro de suporte para identificar a amostra e transfira o para a grade. Uma hora antes do processamento, gire o processador automatizado.
Quando o instrumento indicar que a parafina derreteu, insira manualmente a cesta de metal no processador automatizado. Quando todas as fitas estiverem inseridas, feche a cesta e abra a tampa da réplica. Insira a cesta na carcaça dedicada do processador e feche a tampa da réplica.
Use a tela sensível ao toque no computador de instrumentos para definir o protocolo de trabalho selecionando a sequência de soluções, tempo e temperatura, a serem implementadas de acordo com o esquema fornecido na tabela. Clique no ícone dedicado do computador para atribuir o protocolo à réplica contendo a cesta de e clique no botão iniciar. Quando o instrumento confirmar o fim do protocolo com um ícone dedicado e um tom de alarme, abra a tampa da réplica e remova a cesta do processador.
Uma hora antes da incorporação do tecido, ligue o incorporador automatizado e espere até que a parafina seja completamente derretida, como indicado pelo termômetro do banho de parafina no instrumento. Transfira manualmente até 32 fitas processadas da cesta do processador para o rack do embedder e abra a tampa principal do embedder. Use a tela sensível ao toque para sinalizar ao sistema robótico que um rack está sendo inserido e abrir a tampa da carcaça da entrada.
Insira até quatro racks na carcaça da entrada e feche a tampa da carcaça da entrada. Em seguida, use a tela sensível ao toque para iniciar o procedimento de incorporação, conforme indicado na tabela. Quando o instrumento confirmar o fim do protocolo com o ícone dedicado, remova o rack de saída e feche a tampa principal do embedder.
Em seguida, transfira os blocos incorporados do rack para uma caixa de armazenamento. Encurtamento de cólon, e expressão cólon de genes pro inflamatórios, são parâmetros amplamente utilizados para marcar a presença de sulfato de sódio dextran ou inflamação induzida pelo DSS. A infiltração de células inflamatórias na lavíria intestinal também é muito melhorada pelo tratamento de DSS.
A coloração de H&E de amostras não tratadas processadas pela automação como demonstrado, revela menos células inflamatórias infiltradas, alterações epiteliais e alterações na arquitetura mucosa em comparação com amostras de animais tratados com DSS. A qualidade da preparação e incorporação do tecido murino realizado pelos instrumentos automatizados pode ser confirmada adicionalmente pela coloração imunohistoquímica para CD20 e Mallory Trichrome Staining. Notavelmente, o processamento automatizado de amostras permite consistentemente a avaliação de uma proporção maior de parâmetros histológicos do que as amostras processadas pelo método manual.
Tome cuidado para inserir corretamente o tecido na grade para esperar que o processador automatizado esteja pronto, e esperar que a parafina seja completamente derretida. Este método pode ser usado para realizar análise histológica de qualquer tecido murino, com o qualitivo de amostras histológicas humanas que serão utilizadas em modelos murinos de patologistas humanos. Esta técnica já foi bem sucedida no estudo para o estudo da inflamação do tecido inflamatório, e será útil para estudar modelos de câncer colorretal de murina.
Como alguns reagentes usados neste protocolo são perigosos, lembre-se de sempre usar luvas de proteção, óculos e um jaleco ao realizar este procedimento.
