Este protocolo demostró un método simple y producible para evaluar la capacidad de la fagocitosis de los macrófagos utilizando Escherichia coli, que expresa EGFP. Hola, mi nombre es Jun-Yu de The Second Hospital de la Universidad Médica de Dalian. Hoy vamos a mostrarte una manera fácil y visualizar la manera de evaluar la fagocitosis de macrófagos que se puede hacer fácilmente dentro de dos horas.
Este método fue ampliamente utilizado en el estudio de la función inmune innata. Se cree que la función inmune innata permaneció intacta en los ancianos. Así que hoy vamos a aislar los macrófagos peritoneales de los ratones ancianos y jóvenes y a ver la capacidad fagocítica de estos dos grupos.
Bueno, empecemos. En primer lugar, sintetizar el fragmento del gen EGFP y clonar el fragmento utilizando la polimerasa de ADN Taq de alta fidelidad. A continuación, ligar el producto PCR en el vector pET SUMO.
En tercer lugar, transformar los productos de ligadura en la cepa E.coli e inducir EGFP expresar con lactosa. Estos E.coli que expresan EGFP sirvieron como marcador para el ensayo de fagocitosis. A continuación, se aislaron y cultivaron macrófagos peritoneo de ratón.
Entonces, E.coli, expresión de EGFP, fueron acuñados con los macrófagos durante una hora a 37 grados centigrees. Después de la etapa de enfriamiento, los macrófagos estaban listos para ser evaluados tanto por el microscopio de fluorescencia como por el citómetro de flujo. Sintetice el fragmento del gen EGFP y amplifica el fragmento con una imprimación hacia adelante y hacia atrás utilizando polimerasa de ADN Taq de alta fidelidad.
Para garantizar que los productos de PCR tuvieran voladizos de adenina de tres extremos para clonación de TA en el siguiente paso, se recomienda una extensión de 30 minutos a 72 grados centigrees después del último ciclo. Compruebe el producto PCR mediante electroforesis de gel de agarosa. Si el fragmento se ha amplificado correctamente, se puede observar una banda de 717 bp en el gel.
Clonar el producto PCR en el vector pET SUMO utilizando el método de clonación TA con ligasa de ADN T4. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agregue cinco microlitros de producto PCR en 100 microlitrotro de células competentes para BL21.
Caliente los golpes de las células a 42 grados centígrados durante 90 segundos, luego mantenga la mezcla sobre hielo durante tres minutos. Añadir 400 microlitrotro de medio LB, precalentado a 37 grados centígrados. Temblando una hora a 37 grados centígrados y 120 rpm.
Inocular las bacterias sobre la superficie de la placa LB con 100 microgramos por mililitro de kanamicina para cribar la E.coli transformada en vector. Incubar la placa en el horno de 37 grados centigrees durante la noche. Al día siguiente, inocular una colonia positiva en cinco mililitros de medios LB con 100 microgramos por mililitro de kanamicina.
Incubar en la incubadora de temblores de 37 grados a 120 rpm durante dos horas. A continuación, añadir la lactosa inductora a una concentración final de 0,5 mililitros por litro y continuar agitando seis horas, induciendo la expresión EGFP. Empíricamente, al agitar seis horas, el OD600 puede llegar a 0.7 o superior.
Por último, utilizando el microscopio de fluorescencia para verificar la extensión de la expresión de EGFP. Añadir 10 microlitrotro del medio de cultivo bacteriano a un portaobjetos. A continuación, cubra con un resbalón de cubierta.
Examine la expresión de EGFP bajo el microscopio de fluorescencia. Añadir 3,5 gramos de tioginato en 100 mililitros de agua destilada. Esterilizar en autoclave antes de su uso.
Aspirar el medio de tioboleo en la jeringa estéril de un mililitro en la capucha. Un ratón por jeringa para evitar la infección. Inyecte un mililitro de 3,5% de medio de tiolicivo en la cavidad peritoneal del ratón utilizando una aguja de calibre 23 y mantenga el ratón con agua y alimentos ad libitum durante tres días.
Después de tres días, eutanasia el ratón por luxación cervical después de inducir rápidamente la anestesia por sevoflurano en una caja cerrada. Luego, ponga el ratón en un plato con 75% de etanol a estéril y transfiera a la capucha rápidamente. Coloque el ratón sobre la placa y coloque la pata delantera en la placa para fijar la posición del ratón.
Usando una jeringa de cinco mililitros con una aguja de calibre 20, inyecte cinco mililitros de PBS frío en la parte inferior del abdomen en la cavidad peritoneal del ratón, evitando perforar el intestino. Realice un suave masaje en dos lados del abdomen del ratón. A continuación, aspirar el líquido abdominal suavemente y lentamente.
Dispensar el líquido peritoneal en un tubo centrífugo de 50 mililitros. Repita estos pasos dos o tres veces. Centrifugar las células suspendidas durante 10 minutos a 400 g en cuatro a ocho grados centígrados.
Deseche el sobrenadante y resuspendir el pellet celular en el medio RPMI 1640 con 10%suero bovino fetal. Agregue cinco millones de células a cada pozo de la placa de seis pozos para el ensayo de citometría de flujo y 500.000 células por pozo en una placa de 24 pozos para microscopio de fluorescencia. Cultivo de las células a 37 grados centigrees en una incubadora de dióxido de carbono 5% durante la noche.
El medio de cultivo se puede actualizar después de tres horas para eliminar las células no adherentes porque la mayoría de estos eran linfocitos. Observe las células bajo un microscopio de campo brillante para evaluar la viabilidad celular y la densidad celular. La imagen que se muestra aquí estaba en condiciones normales de la celda primaria.
Por lo general, la densidad celular del macrófago no era alta, porque la mayor parte de las células peritoneales eran linfocitos. Retire el medio de cultivo de la placa de 24 pozos. Añadir 100 microlitrotro de medio de cultivo fresco y 10 microlitrotro de medio bacteriano.
Luego incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono del 5% durante una hora. Lavar suavemente con 500 microlitro de PBS frío por pozo de tres a cinco veces para lavar las bacterias no internalizadas. Incubar las células con 4%formaldehído en PBS a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Lave las células con PBS tres veces. Añadir solución de trabajo conjugada de faloide 633 para manchar la F-actina. Conservar en un lugar oscuro y húmedo a temperatura ambiente durante 60 minutos.
Agregue la solución de trabajo DAPI para manchar la célula nuclear e incubar durante cinco minutos en un lugar oscuro a temperatura ambiente. Enjuagar una vez con PBS y una vez con el mismo volumen en agua destilada. El E.coli que expresa EGFP en verde sirvió como marcador de fagocitosis.
Para minimizar los errores experimentales y hacer una interpretación adecuada de los resultados, establezca grupos y tubos de control para el experimento como se indica en la Tabla 2. Para el grupo de control que se colocará sobre el hielo, retire el medio de la placa de seis pozos y lave con PBS una vez. Luego agregue 70 mililitros por litro de EDTA frío un mililitro en el pozo para separar las células y transferirlas al tubo de citometría de flujo.
Agregue 50 microlitro de suspensión bacteriana en el tubo y colóquelo en el hielo durante una hora. Para los otros grupos, retire el medio de cultivo, agregue un medio fresco mililitro en cada pozo. Añadir 50 microlitro de suspensión de bacterias en los pozos de acuerdo con la configuración del grupo como se describe en la tabla dos.
A continuación, coloque la placa de seis pozos en la incubadora de 37 grados centigrees 5% de dióxido de carbono durante una hora. Para apagar la fluorescencia de E.coli no internalizado, agregue 200 microlitrotro de 0.8% de solución de agua violeta cristalina en el pozo y se balancee en breve. Este paso pretendía evitar el resultado falso positivo mediante la unión EGFP E.coli a la superficie de los macrófagos pero no interiorizado.
Lavar las células con PBS tres veces para eliminar cualquier cristal violeta residual. Luego agregue 70 mililitros por litro de EDTA frío un mililitro en el pozo para separar las células y transferirlas al tubo de citometría de flujo. Centrifugar los tubos 2.000 rpm cinco minutos y desechar el sobrenadante.
Agregue 100 microlitros de PBS para resuspender las células. Agregue cinco microlitros de anticuerpo conjugado F4 ATP en los tubos o isotipos según la configuración del grupo. Vortex brevemente e incubar las muestras sobre hielo durante cinco a 10 minutos en la oscuridad.
Añadir un mililitro DE PBS en cada tubo y centrifugar 2.000 rpm cinco minutos. Deseche el sobrenadante. Resuspender los gránulos celulares con 200 a 300 microlitros de PBS para el análisis de citometría de flujo.
Ejecute cada tubo y adquiera datos para al menos 10.000 eventos de células F4/80 positivas. Aquí están las imágenes de fluorescencia de los macrófagos peritoneales de los grupos jóvenes y envejecidos. La fluorescencia roja representa F-actina.
El verde representa E.coli, expresión de EGFP, y el azul representa el núcleo manchado por DAPI. Estas imágenes sugieren que los macrófagos del ratón joven tenían una capacidad fagocítica más fuerte que los del ratón envejecido. Las células F4/80-positivas y EGFP-positivas indicaron la capacidad fagocítica de los macrófagos.
Estos resultados son consistentes con la tendencia de los resultados del microscopio de fluorescencia. Bueno, ya ves, aunque el número de las células inmunitarias innatas puede preservarse en ratón envejecido, la capacidad fagocítica disminuyó significativamente en comparación con el ratón joven. Se han empleado muchos métodos para evaluar la fagocitosis macrófago.
Aquí demostramos un método mejorado que es conveniente, rápido y económicamente factible. Con E.coli, expresión de EGFP, un ensayo de fagocitosis se puede realizar y medir fácilmente mediante citómetro de flujo y microscopio fluorescente según las preferencias del investigador. También este método mide directamente la capacidad fagocítica.
Los resultados son más reproducibles que otros métodos indirectos.
