פרוטוקול זה הדגים שיטה פשוטה ו producible להעריך את יכולת phagocytosis של מקרופאגים באמצעות EGFP-מבטא Escherichia coli. שלום, שמי ג'ון-יו מבית החולים השני של האוניברסיטה הרפואית של דאליאן. היום אנחנו הולכים להראות לך קל לדמיין את הדרך להעריך phagocytosis מקרופאג אשר ניתן לעשות בקלות בתוך שעתיים.
שיטה זו הייתה בשימוש נרחב בחקר תפקוד מערכת החיסון המולדת. הוא האמין כי תפקוד חיסוני המולד נשאר שלם אצל קשישים. אז היום אנחנו הולכים לבודד את המקרופאגים הפניטון מהעכברים הצעירים והמבוגרים ולראות את היכולת הפוגוציטית של שתי הקבוצות האלה.
ובכן, בואו נתחיל. ראשית, לסנתז את שבר הגן EGFP ולשכפל את השבר באמצעות פולימראז DNA Taq נאמנות גבוהה. לאחר מכן לצרף את מוצר PCR לתוך וקטור סומו PET.
שלישית, להפוך את מוצרי קשירה לתוך זן E.coli ולזרז EGFP הבעה עם לקטוז. E.coli מבטאים EGFP אלה שימשו כסמן לבדיקת הפאגוציטוזיס. לאחר מכן, מקרופאגים של צפאגים של עכברים היו מבודדים ותרבותים.
לאחר מכן, E.coli מבטא EGFP היו coincubated עם מקרופאגים במשך שעה אחת ב 37 מעלות סנטימטרים. לאחר שלב המיתון, המקרופאגים היו מוכנים להערכה הן על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי והן על ידי ציטומטר זרימה. לסנתז את שבר הגן EGFP ולהעצים את השבר עם פריימרים קדימה ואחורי באמצעות פולימראז DNA Taq נאמנות גבוהה.
כדי להבטיח כי מוצרי PCR היו אחד שלושה קצה אדנין overhangs עבור שיבוט ת"א בשלב הבא, הרחבה של 30 דקות ב 72 מעלות centigrees לאחר המחזור האחרון מומלץ. בדוק את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז. אם השבר הוגבר כראוי, ניתן לראות רצועת 717 bp על הג'ל.
לשכפל את המוצר PCR לתוך וקטור סומו PET באמצעות שיטת שיבוט ת"א עם קשירה DNA T4. הדגירה את התגובה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. הוסף חמישה מיקרוליטר של מוצר PCR לתוך 100 מיקרוליטר של תאים מוסמכים BL21.
החום מזעזע את התאים ב-42 מעלות במשך 90 שניות, ואז שומר את התערובת על הקרח למשך שלוש דקות. הוסף 400 מיקרוליטר של LB בינוני, שחומם מראש ב 37 מעלות centigrees. רועד שעה ב 37 מעלות צל"ש ו 120 סל"ד.
לחסן את החיידקים על פני השטח של צלחת LB עם 100 מיקרוגרם למיליליטר kanamycin כדי לסנן את וקטור טרנספורמציה E.coli. דגירה את הצלחת בתנור 37 מעלות צלסינרים לילה. ביום שלמחר, לחסן מושבה חיובית לחמישה מיליליטר של מדיה LB עם 100 מיקרוגרם למיליליטר kanamycin.
אינקובט בסנטיגרנים של 37 מעלות רועד אינקובטור ב 120 סל"ד במשך שעתיים. לאחר מכן מוסיפים את הלקטוז המושרה לריכוז סופי של 0.5 מילימול לליטר וממשיכים לרעוד שש שעות, מה שגרם לביטוי EGFP. באופן אמפירי, כאשר רועדים שש שעות, OD600 עשוי להגיע 0.7 ומעלה.
לבסוף, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת את היקף ההבעה של EGFP. הוסף 10 מיקרוליטר של מדיום תרבות החיידקים לשקופית. ואז לכסות עם פתק כיסוי.
בחן את הביטוי של EGFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מוסיפים 3.5 גרם של תיוגליקולאט ל-100 מיליליטר מים מזוקקים. יש לעקר במקלה אוטומטית לפני השימוש.
שאף את מדיום התיוגליקולאט למזרק הסטרילי של מיליליטר אחד בשכונה. עכבר אחד לכל מזרק כדי למנוע את הזיהום. להזריק מיליליטר אחד של 3.5% thioglycollate בינוני לתוך חלל הלידה העכבר באמצעות מחט 23-מד ולשמור על העכבר עם מים ומזון עד ליביטום במשך שלושה ימים.
לאחר שלושה ימים, המתת את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם לאחר גרימת הרדמה במהירות על ידי sevoflurane בתיבה סגורה. לאחר מכן, לשים את העכבר לתוך צלחת עם 75% אתנול סטרילי ולהעביר לתוך מכסה המנוע במהירות. מניחים את העכבר על הצלחת ולהצמיד את הכף הקדמית על הלוח כדי לתקן את מיקום העכבר.
באמצעות מזרק חמישה מיליליטר עם מחט 20-מד, להזריק חמישה מיליליטר של PBS קר בבטן התחתונה לתוך חלל הצפי של העכבר, הימנעות מנקב את המעי. בצע עיסוי עדין משני צידי הבטן של העכבר. ואז לשוגם את נוזל הבטן בעדינות ולאט.
מחלקים את הנוזל צפק לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. חזור על שלבים אלה פעמיים או שלוש. צנטריפוגה התאים המושעים במשך 10 דקות ב 400 גרם בארבעה עד שמונה סנטימטרים.
השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את גלולת התא במדיום RPMI 1640 עם סרום לב עוברי 10%. הוסף חמישה מיליון תאים לתוך כל באר של צלחת שש בארות עבור בדיקה cytometry זרימה ו 500, 000 תאים לתוך צלחת 24 באר עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תרבו את התאים ב-37 מעלות באינקובטור של 5%פחמן דו-חמצני בן לילה.
מדיום התרבות ניתן לרענן לאחר שלוש שעות כדי להסיר תאים לא עקביים כי רוב אלה היו לימפוציטים. שים לב לתאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כדי להעריך את הכדאיות של התא ואת צפיפות התאים. התמונה המוצגת כאן הייתה במצב רגיל של התא הראשי.
בדרך כלל, צפיפות תאי המקרופאג' לא הייתה גבוהה, מכיוון שחלק מרכזי של התאים הצפיוניים היה לימפוציטים. מוציאים את מדיום התרבות מהצלחת של 24 בארות. הוסף 100 מיקרוליטר של תרבות טרייה בינונית ו 10 microliter של מדיום חיידקי.
ואז להידגר את הצלחת ב 37 מעלות צליגה ב 5% פחמן דו חמצני אינקובטור במשך שעה אחת. לשטוף בעדינות עם 500 microliter של PBS קר לגם שלוש עד חמש פעמים כדי לשטוף חיידקים שאינם הפנימו. הדגירה את התאים עם 4% פורמלדהיד ב PBS בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. הוסף פאלודין 633 תוסף פתרון עבודה כתם F-actin. יש לאחסן במקום חשוך ולח בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
הוסף פתרון עבודה DAPI כדי להכתים את התא גרעיני דגירה במשך חמש דקות במקום חשוך בטמפרטורת החדר. יש לשטוף פעם אחת עם PBS ופעם עם אותו נפח במים מזוקקים. ה- E.coli המבטא את EGFP המוצג בירוק שימש כסמן של phagocytosis.
כדי למזער שגיאות ניסיוניות ולהפוך פרשנות נכונה של התוצאות, הגדר קבוצות וצינורות בקרה עבור הניסוי כמפורט בטבלה 2. עבור קבוצת הביקורת אשר יונח על הקרח, להסיר את המדיום מן הצלחת שש באר לשטוף עם PBS פעם אחת. לאחר מכן להוסיף 70 מילימול לליטר קר EDTA מיליליטר לתוך באר כדי לנתק את התאים ולהעביר לתוך צינור ציטומטריה זרימה.
מוסיפים 50 מיקרוליטר של מתלה חיידקי לתוך הצינור ומ מניחים אותו על הקרח במשך שעה אחת. עבור הקבוצות האחרות, להסיר את מדיום התרבות, להוסיף מדיום טרי מיליליטר אחד לתוך כל באר. הוסף 50 microliter של השעיית חיידקים לתוך בארות על פי הגדרת הקבוצה כמתואר בטבלה 2.
ואז למקם את הצלחת שש באר ב 37 מעלות centigrees 5% פחמן דו חמצני אינקובטור במשך שעה אחת. כדי להתרווה על הפלואורסצנטיות של E.coli שאינו מופנם, להוסיף 200 מיקרוליטר של 0.8% פתרון מים סגולים גבישיים לתוך הבאר ולהתנדנד בקרוב. שלב זה נועד למנוע תוצאה חיובית שגויה על ידי איגוד EGFP E.coli לפני השטח של מקרופאגים אך לא הופנם.
לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים כדי להסיר כל סגול גביש שיורית. לאחר מכן להוסיף 70 מילימול לליטר קר EDTA מיליליטר לתוך באר כדי לנתק את התאים ולהעביר לתוך צינור ציטומטריה זרימה. צנטריפוגה הצינורות 2, 000 סל"ד חמש דקות ולהשליך את supernatant.
הוסף 100 מיקרוליטר של PBS כדי לעשות שימוש חוזר בתאים. הוסף חמישה microliter של F4 ATP הוסיף נוגדן לתוך הצינורות או isotype על פי הגדרת הקבוצה. מערבולת לזמן קצר להדגר את הדגימות על קרח במשך חמש עד 10 דקות בחושך.
הוסף PBS מיליליטר אחד לתוך כל צינור צנטריפוגה 2, 000 סל"ד חמש דקות. השלך את העל-טבעי. תן שוב את כדורי התא עם 200 עד 300 מיקרוליטר של PBS לניתוח ציטומטריה זרימה.
הפעל כל צינור ורכוש נתונים עבור לפחות 10,000 אירועים של תאים חיוביים F4/80. הנה תמונות פלואורסצנטיות של מקרופאגים צפורים מהקבוצות הצעירות וההתיישנות. הפלואורסצנטיות האדומה מייצגת את F-actin.
הירוק מייצג E.coli מבטא EGFP, והכחול מייצג גרעין מוכתם על ידי DAPI. תמונות אלה מצביעות על כך שלמפאגים מהעכבר הצעיר הייתה יכולת phagocytic חזקה יותר מאלה של העכבר המזדקן. התאים החיוביים וה-EGFP החיוביים של F4/80 הצביעו על היכולת הפאגוציטית של המקרופאגים.
תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם המגמה של תוצאות מיקרוסקופ פלואורסצנטיות. ובכן, אתה רואה, למרות שמספר תאי החיסון המולדים עשוי להישמר בעכבר מיושן, היכולת הפוגוציטית ירדה באופן משמעותי בהשוואה לעכבר הצעיר. שיטות רבות נעשה כדי להעריך מקרופאג phagocytosis.
כאן אנו מדגימים שיטה משופרת נוחה, מהירה וישימה מבחינה כלכלית. עם EGFP-ביטוי E.coli, בדיקה phagocytosis ניתן לבצע בקלות ולמדוד על ידי ציטומטר זרימה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי על פי העדפות החוקר. גם שיטה זו מודדת ישירות את היכולת הphagocytic.
התוצאות ניתנות לשחזור יותר משיטות עקיפות אחרות.
