Questo protocollo ha dimostrato un metodo semplice e producibile per valutare la capacità di fagocitosi dei macrofagi usando Escherichia coli che esprime EGFP. Ciao, mi chiamo Jun-Yu del Secondo Ospedale della Dalian Medical University. Oggi vi mostreremo un facile e visualizzeremo il modo di valutare la fagocitosi del macrofago che può essere facilmente eseguita entro due ore.
Questo metodo è stato ampiamente utilizzato nello studio della funzione immunitaria innata. Si ritiene che la funzione immunitaria innata sia rimasta intatta negli anziani. Quindi oggi isoliamo i macrofagi peritoneali dai topi anziani e giovani e vediamo la capacità fagocitica di questi due gruppi.
Beh, cominciamo. In primo luogo, sintetizzare il frammento genico EGFP e clonare il frammento usando dna polimerasi Taq ad alta fedeltà. Quindi ligare il prodotto PCR nel vettore sumo pET.
In terzo luogo, trasformare i prodotti di legatura nel ceppo E.coli e indurre EGFP ad esprimere con lattosio. Questi E.coli che esprimevano L'EGFP servivano come marcatore per il saggio di fagocitosi. Successivamente, un peritoneo macrofagi del topo fu isolato e coltivato.
Quindi, gli E.coli che esprimevano l'EGFP furono coincubati con i macrofagi per un'ora a 37 gradi centigrei. Dopo la fase di tempra, i macrofagi erano pronti per la valutazione sia dal microscopio a fluorescenza che dal citometro a flusso. Sintetizzare il frammento genico EGFP e amplificare il frammento con un primer avanti e indietro usando dna polimerasi Taq ad alta fedeltà.
Per garantire che i prodotti PCR avessero singoli sporgenze adenine a tre estremità per la clonazione dell'AT nel passaggio successivo, si raccomanda un'estensione di 30 minuti a 72 gradi centigrei dopo l'ultimo ciclo. Controllare il prodotto PCR mediante elettroforesi in gel di agarosio. Se il frammento è stato amplificato correttamente, si può osservare una banda di 717 bp sul gel.
Clonare il prodotto PCR nel vettore pET SUMO utilizzando il metodo di clonazione TA con T4 DNA ligasi. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere cinque microliter di prodotto PCR in 100 microliter di cellule competenti BL21.
Scaldare le cellule a 42 gradi centigrei per 90 secondi, quindi mantenere la miscela sul ghiaccio per tre minuti. Aggiungere 400 microliter di mezzo LB, preriscaldato a 37 gradi centigrei. Tremante di un'ora a 37 gradi centigrei e 120 giri/min.
Inoculare i batteri sulla superficie della piastra LB con 100 microgrammi per millilitro kanamicina per schermare l'E.coli trasformato da vettori. Incubare la piastra nel forno a 37 gradi centigrei durante la notte. Il giorno successivo, inoculare una colonia positiva in cinque millilitri di litra di liscivie con 100 microgrammi per millilitro kanamicina.
Incubare nell'incubatrice di scuotimento a 37 gradi centigrees a 120 giri/min per due ore. Quindi aggiungere il lattosio induttore a una concentrazione finale di 0,5 millimoli per litro e continuare a tremare per sei ore, inducendo espressione EGFP. Empiricamente, quando si tremano sei ore, l'OD600 può raggiungere 0,7 o superiore.
Infine, utilizzando il microscopio a fluorescenza per verificare l'estensione dell'espresso EGFP. Aggiungere 10 microliter del mezzo di coltura batterica a uno scivolo. Quindi coprire con un foglietto di copertura.
Esaminare l'espressione di EGFP al microscopio a fluorescenza. Aggiungere 3,5 grammi di tioglicollato in 100 millilitri di acqua distillata. Sterilizzare in autoclave prima dell'uso.
Aspirare il mezzo tioglicollato nella siringa sterile da un millilitro nel cappuccio. Un topo per siringa per evitare l'infezione. Iniettare un millilitro di mezzo tioglicollato al 3,5% nella cavità peritoneale del topo utilizzando un ago calibro 23 e mantenere il topo con acqua e ad libitum alimentare per tre giorni.
Dopo tre giorni, eutanasiare il topo con la lussazione cervicale dopo aver introdotto rapidamente l'anestesia da sevoflurane in una scatola chiusa. Quindi, mettere il topo in un piatto con il 75% di etanolo per sterile e trasferire rapidamente nel cappuccio. Posizionare il mouse sulla piastra e fissare la zampa anteriore sulla tavola per fissare la posizione del mouse.
Utilizzando una siringa da cinque millilitri con un ago calibro 20, iniettare cinque millilitri di PBS freddo all'addome inferiore nella cavità peritoneale del topo, evitando di forare l'intestino. Eseguire un massaggio delicato su due lati dell'addome del mouse. Quindi aspirare il fluido addominale delicatamente e lentamente.
Erogare il fluido peritoneale in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Ripetere questi passaggi due o tre volte. Centrifugare le cellule sospese per 10 minuti a 400 g in quattro-otto centigradi.
Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare nel mezzo RPMI 1640 con siero bovino fetale al 10%. Aggiungere cinque milioni di cellule in ogni pozzo della piastra a sei pozzi per il saggio di citometria del flusso e 500.000 cellule per pozzo in una piastra da 24 porri per microscopio a fluorescenza. Coltura delle cellule a 37 gradi centigrees in un incubatore di anidride carbonica del 5% durante la notte.
Il mezzo di coltura può essere aggiornato dopo tre ore per rimuovere le cellule non aerenti perché la maggior parte di questi erano linfociti. Osservare le cellule al microscopio a campo luminoso per valutare la vitalità cellulare e la densità cellulare. L'immagine mostrata qui era in condizioni normali della cella primaria.
Di solito, la densità cellulare del macrofago non era alta, perché la maggior parte delle cellule peritoneali erano linfociti. Rimuovere il mezzo di coltura dal piatto da 24 pozzi. Aggiungere 100 microliter di mezzo di coltura fresco e 10 microliter di mezzo batterico.
Quindi incubare la piastra a 37 gradi centigrees in un incubatore di anidride carbonica del 5% per un'ora. Lavare delicatamente con 500 microliter di PBS freddo per pozzo da tre a cinque volte per lavare i batteri non internalizzati. Incubare le cellule con il 4% di formaldeide in PBS a temperatura ambiente per 30 minuti.
Lavare le cellule con PBS tre volte. Aggiungere la soluzione di lavoro coniugata phalloidin 633 per macchiare F-actin. Conservare in un luogo buio e umido a temperatura ambiente per 60 minuti.
Aggiungere la soluzione di lavoro DAPI per macchiare la cellula nucleare e incubare per cinque minuti in un luogo buio a temperatura ambiente. Risciacquare una volta con PBS e una volta con lo stesso volume in acqua distillata. L'E.coli espresso dall'EGFP visualizzato in verde fungeva da marcatore della fagocitosi.
Per ridurre al minimo gli errori sperimentali ed effettuare una corretta interpretazione dei risultati, impostare gruppi e tubi di controllo per l'esperimento elencati nella tabella 2. Per il gruppo di controllo che verrà posizionato sul ghiaccio, rimuovere il mezzo dalla piastra a sei pozzi e lavare con PBS una volta. Quindi aggiungere 70 millimoli per litro di EDTA fredda un millilitro nel pozzo per staccare le cellule e trasferirlo nel tubo di citometria a flusso.
Aggiungere 50 microliter di sospensione batterica nel tubo e posizionarlo sul ghiaccio per un'ora. Per gli altri gruppi, rimuovere il mezzo di coltura, aggiungere un mezzo fresco millilitro in ogni pozzo. Aggiungere 50 microliter di sospensione batteriche nei pozzi in base all'impostazione del gruppo descritta nella tabella due.
Quindi posizionare la piastra di sei pozzi nell'incubatore di anidride carbonica a 37 gradi centigrees del 5% per un'ora. Per spegnere la fluorescenza dell'E.coli non interiorizzato, aggiungere 200 microliter di soluzione di acqua cristallina allo 0,8% nel pozzo e ondeggiare a breve. Questo passaggio ha lo scopo di evitare risultati falsi positivi da parte dell'associazione EGFP E.coli alla superficie dei macrofagi ma non interiorizzati.
Lavare le cellule con PBS tre volte per rimuovere eventuali viola cristallini residui. Quindi aggiungere 70 millimoli per litro di EDTA fredda un millilitro nel pozzo per staccare le cellule e trasferirlo nel tubo di citometria a flusso. Centrifugare i tubi 2.000 giri/min di cinque minuti e scartare il supernatante.
Aggiungere 100 microliter di PBS per rimospendare le cellule. Aggiungere cinque microliter di anticorpo coniugato F4 ATP nei tubi o nell'isotipo in base all'impostazione del gruppo. Vortice brevemente e incubare i campioni sul ghiaccio per cinque-10 minuti al buio.
Aggiungere un PBS millilitro in ogni tubo e centrifugare 2.000 giri/min di cinque minuti. Scartare il supernatante. Resuspend il pellet cellulare con 200-300 microliter di PBS per l'analisi della citometria a flusso.
Eseguire ogni tubo e acquisire dati per almeno 10.000 eventi di celle positive F4/80. Ecco le immagini a fluorescenza dei macrofagi peritoneali dei gruppi giovani e anziani. La fluorescenza rossa rappresenta f-actina.
Il verde rappresenta l'E.coli che esprime EGFP, e il blu rappresenta il nucleo macchiato da DAPI. Queste immagini suggeriscono che i macrofagi del giovane topo avessero una capacità fagocitica più forte di quelli del topo invecchiato. Le cellule positive F4/80 ed EGFP indicavano la capacità fagocitica dei macrofagi.
Questi risultati sono coerenti con l'andamento dei risultati del microscopio a fluorescenza. Beh, vedete, anche se il numero delle cellule immunitarie innate può essere conservato nel topo invecchiato, la capacità fagocitica è diminuita significativamente rispetto al giovane topo. Molti metodi sono stati impiegati per valutare la fagocitosi macrofagia.
Qui dimostriamo un metodo migliorato che è conveniente, rapido ed economicamente fattibile. Con E.coli che esprime EGFP, un saggio di fagocitosi può essere facilmente eseguito e misurato sia dal citometro a flusso che dal microscopio fluorescente secondo le preferite del ricercatore. Anche questo metodo misura direttamente la capacità fagocitica.
I risultati sono più riproducibili di altri metodi indiretti.
