이 프로토콜은 EGFP 표현 대장균을 사용하여 대식세포의 식세포 능력을 평가하는 간단하고 유익한 방법을 시연하였다. 안녕하세요, 제 이름은 다롄 의과 대학 제2병원의 준유입니다. 오늘 우리는 당신에게 쉽게 보여주고 쉽게 2 시간 이내에 수행 할 수있는 대식 세포증을 평가하는 방법을 시각화 할 것입니다.
이 방법은 타고난 면역 기능의 연구에서 널리 사용되었다. 선천적인 면역 기능은 노인에 그대로 남아 있는 것으로 여겨진다. 그래서 오늘 우리는 노인과 젊은 마우스에서 복막 대식제를 분리하고이 두 그룹의 phagocytic 능력을 볼 것입니다.
글쎄, 시작하자. 먼저, EGFP 유전자 단편을 합성하고 고충실도 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 단편을 복제한다. 그런 다음 PCR 제품을 pET SUMO 벡터로 리게이트합니다.
셋째, 결찰 제품을 대장균 균주로 변환하고 유당으로 발현하는 EGFP를 유도한다. 이러한 EGFP 표현 E.coli는 phagocytosis 분석의 마커역할을 하였다. 다음으로, 마우스 회막 대식세포가 분리되고 배양되었다.
그런 다음 EGFP를 표현하는 대장균은 37도 센티미터에서 1시간 동안 대식세포로 주조되었습니다. 담금질 단계 후, 대식세포는 형광 현미경 과 유동 세포계 모두에 의해 평가할 준비가 되었습니다. EGFP 유전자 단편을 합성하고 고충실도 Taq DNA 폴리머라아제를 사용하여 전방 및 역 프라이머로 조각을 증폭시한다.
PCR 제품에 다음 단계에서 TA 복제를 위한 단일 3 엔드 아데닌 오버행이 있는지 확인하려면 마지막 주기 후 72도 에서 30 분 연장이 권장됩니다. 아가로즈 젤 전기포고증으로 PCR 제품을 확인하십시오. 단편이 올바르게 증폭되면, 717 bp 대역은 겔에서 관찰될 수 있다.
T4 DNA 리구아제와 TA 복제 방법을 사용하여 PCR 제품을 pET SUMO 벡터로 복제한다. 30 분 동안 실온에서 반응을 배양. BL21 유능한 셀의 100 마이크로 리터에 PCR 제품의 5 마이크로 리터를 추가합니다.
세포를 42도 센티미터에서 90초 동안 열충격을 가한 다음 혼합물을 얼음에 3분간 보관합니다. 37도 센티미터에서 예열된 LB 배지 400 마이크로리터를 추가합니다. 37도 센티미터와 120 rpm에서 한 시간 동안 흔들리고 있습니다.
벡터 변환 된 대장균을 선별하기 위해 밀리리터 카나마이신 당 100 마이크로 그램으로 LB 플레이트표면에 박테리아를 접종합니다. 접시를 37도 센테리스 오븐에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 밀리리터 카나마이신 당 100 마이크로그램으로 LB 미디어의 5 밀리리터로 양성 식민지를 접종.
2 시간 동안 120 rpm에서 37도 센티미터 의 인큐베이터 흔들어 인큐베이터에서 배양하십시오. 그런 다음 유도유당을 리터당 0.5 밀리몰의 최종 농도에 추가하고 EGFP 발현을 유도하여 6시간 동안 계속 흔들어 있다. 경험적으로, 6 시간 흔들 때, OD600에 도달 할 수있다 0.7 이상.
마지막으로, 형광 현미경을 사용하여 EGFP 발현의 정도를 확인합니다. 세균 배양 배지의 마이크로리터 10마이크로리터를 슬라이드에 추가합니다. 그런 다음 커버 슬립으로 덮습니다.
형광 현미경의 밑에 EGFP의 발현을 검사합니다. 증류수 100밀리리터에 3.5그램의 티오글리콜레이트를 넣습니다. 사용하기 전에 자동 복제로 살균하십시오.
티오글리콜레이트 배지를 후드의 1밀리리터 멸균 주사기로 흡인시합니다. 감염을 피하기 위해 주사기 당 하나의 마우스. 23 게이지 바늘을 사용하여 마우스 복막 구멍에 3.5 %의 티오글리콜레이트 배지 1 밀리리터를 주입하고 3 일 동안 물과 음식 광고 리비툼으로 마우스를 유지합니다.
3 일 후, 폐쇄 된 상자에 세보플루란에 의해 마취를 신속하게 유도 한 후 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사. 그런 다음 마우스를 75%에탄올로 접시에 넣고 멸균하고 후드로 빠르게 옮습니다. 접시에 마우스를 놓고 마우스 위치를 수정하기 위해 보드에 전면 발을 고정합니다.
20 게이지 바늘이 있는 5밀리리터 주사기를 사용하여, 하복부에 차가운 PBS 5밀리리터를 마우스 복막 구멍에 주입하여 창자에 구멍을 뚫지 않도록 하십시오. 마우스 복부의 양면에 부드러운 마사지를 수행합니다. 그런 다음 복부 액을 부드럽고 천천히 흡인시합니다.
복막 유체를 50밀리리터 원심분리기 튜브에 분배합니다. 이 단계를 두 세 번 반복합니다. 4-8 센티미터에서 400g에서 10 분 동안 중단 된 세포를 원심 분리합니다.
10%의 태아 소 혈청으로 RPMI 1640 배지에서 상체를 버리고 세포 펠릿을 재연한다. 유동 세포 분석 분석및 500, 000 세포당 500개의 세포를 형광 현미경을 위한 24웰 플레이트에 5백만 개의 세포를 첨가합니다. 하룻밤 사이에 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 37도 센티미터로 배양합니다.
배양 배지는 이들 대부분이 림프구이기 때문에 3시간 후에 비부착 세포를 제거하기 위해 새로 고칠 수 있다. 밝은 필드 현미경으로 세포를 관찰하여 세포 생존력과 세포 밀도를 평가한다. 여기에 표시된 이미지는 기본 셀의 정상적인 상태였습니다.
일반적으로, 대식세포 밀도는 높지 않았고, 이는 하막 세포의 주요 부분이 림프구이기 때문이다. 24웰 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다. 신선한 배양 배지 100 마이크로리터와 세균 성 배지 10 마이크로 리터를 추가합니다.
그런 다음 1 시간 동안 5 %의 이산화탄소 인큐베이터에서 37도 센티미터에서 플레이트를 배양합니다. 3~5회 감기 PBS 500 마이크로리터로 부드럽게 씻어 내면화되지 않은 박테리아를 씻어냅니다. 실온에서 PBS에서 4%의 포름알데히드로 세포를 30분 동안 배양합니다.
PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. P할로이딘 633 컨쥬게이트 작업 용액을 첨가하여 F-액틴을 얼룩지게 합니다. 실온에서 어둡고 습한 장소에 60분간 보관하십시오.
DAPI 작업 용액을 추가하여 세포 핵을 염색하고 실온의 어두운 장소에서 5 분 동안 배양하십시오. PBS로 한 번 헹구고 증류수에서 동일한 부피를 한 번 헹구습니다. 녹색으로 표시된 EGFP 표현 E.coli는 phagocytosis의 마커역할을 했습니다.
실험 오류를 최소화하고 결과를 적절하게 해석하려면 표 2에 나열된 실험에 대한 그룹 및 제어 튜브를 설정합니다. 얼음 위에 놓일 대조군의 경우, 6웰 플레이트에서 배지를 제거하고 PBS로 한 번 세척합니다. 그런 다음 리터 콜드 EDTA 1 밀리리터당 70밀리몰을 우물에 추가하여 세포를 분리하고 유동 세포측정 관으로 옮춥니다.
50 마이크로리터의 세균 현탁액을 튜브에 넣고 1시간 동안 얼음 위에 놓습니다. 다른 그룹의 경우 배양 배지를 제거하고 각 웰에 1 밀리리터 신선한 배지를 추가합니다. 표 2에 설명된 바와 같이 그룹 설정에 따라 50 마이크로리터의 박테리아 현탁액을 우물에 넣습니다.
그런 다음 6웰 플레이트를 37도 센티미터에 5%의 이산화탄소 인큐베이터를 1시간 동안 배치합니다. 비내부화 E.coli의 형광을 담금질하려면 0.8 %의 크리스탈 바이올렛 워터 용액 200 마이크로 리터를 우물에 넣고 곧 흔들리고 있습니다. 이 단계는 대식세포 표면에 결합하지만 내부화되지 않은 EGFP E.coli에 의한 거짓 양성 결과를 피하기 위한 것입니다.
PBS로 셀을 세 번 씻아 잔류 결정 바이올렛을 제거하십시오. 그런 다음 리터 콜드 EDTA 1 밀리리터당 70밀리몰을 우물에 추가하여 세포를 분리하고 유동 세포측정 관으로 옮춥니다. 원심 분리 튜브 2, 000 rpm 5 분 및 상체를 폐기.
세포를 다시 중단하기 위해 PBS의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 그룹 설정에 따라 F4 ATP 공액 항체5마이크로리터를 튜브 또는 동종타입에 첨가한다. 소용돌이는 어둠 속에서 5~10분 동안 얼음 에 샘플을 잠깐 배양합니다.
각 튜브와 원심분리기 2, 000 rpm 5분에 밀리리터 PBS 1개를 추가합니다. 상부체를 폐기합니다. 유동 세포 측정 분석을 위해 PBS의 200 에서 300 마이크로 리터로 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
각 튜브를 실행하고 F4/80 양성 세포의 적어도 10, 000 이벤트에 대한 데이터를 수집합니다. 다음은 젊고 노인 집단의 복막 대식세포형형 이미지입니다. 적색 형광은 F-액틴을 나타낸다.
녹색은 EGFP 표현 E.coli를 나타내고, 파란색은 DAPI에 의해 얼룩진 핵을 나타낸다. 이 심상은 젊은 마우스에서 대식세포가 숙성 마우스에서 그 보다는 더 강한 phagocytic 능력을 가지고 있었다는 것을 건의합니다. F4/80 양성 및 EGFP 양성 세포는 대식세포의 식세포 능력을 나타냈다.
이러한 결과는 형광 현미경 결과의 추세와 일치합니다. 글쎄, 당신은 볼, 타고난 면역 세포의 수는 노인 마우스에서 보존 할 수 있지만, phagocytic 능력은 젊은 마우스에 비해 크게 감소. 대식세포증을 평가하기 위해 많은 방법이 사용되었습니다.
여기에서 우리는 편리하고 빠르며 경제적으로 실현 가능한 개선 된 방법을 보여줍니다. EGFP 발현 E.coli를 사용하면 연구원의 선호도에 따라 유동 세포계와 형광 현미경으로 쉽게 수행하고 측정할 수 있습니다. 또한이 방법은 직접 phagocytic 능력을 측정합니다.
결과는 다른 간접 적인 방법 보다 더 재현.
