Este protocolo demonstrou um método simples e produtível para avaliar a capacidade de fagocitose de macrófagos usando Escherichia coli expressante pelo EGFP. Olá, meu nome é Jun-Yu do Segundo Hospital da Universidade Médica de Dalian. Hoje vamos mostrar-lhe uma maneira fácil e visualizar a maneira de avaliar a fagocitose macrófago que pode ser facilmente feito dentro de duas horas.
Este método foi amplamente utilizado no estudo da função imunológica inata. Acredita-se que a função imunológica inata permaneceu intacta em idosos. Então hoje vamos isolar os macrófagos peritoneal dos camundongos idosos e jovens e ver a capacidade fagocítica desses dois grupos.
Bem, vamos começar. Em primeiro lugar, sintetize o fragmento genético EGFP e clone o fragmento usando polimerase de DNA Taq de alta fidelidade. Em seguida, liga o produto PCR no vetor pET SUMO.
Em terceiro lugar, transforme os produtos de ligadura na cepa E.coli e induza a expressão EGFP com lactose. Estes E.coli expressos em EGFP serviram como o marcador para o ensaio de fagocitose. Em seguida, um macrófago de peritônio do rato foi isolado e cultivado.
Em seguida, egfp-expressing E.coli foram coincubated com os macrófagos por uma hora a 37 graus centígrees. Após a etapa de saciamento, os macrófagos estavam prontos para avaliação tanto pelo microscópio de fluorescência quanto pelo citômetro de fluxo. Sintetizar o fragmento genético EGFP e amplificar o fragmento com um primers para frente e para trás usando polimerase de DNA Taq de alta fidelidade.
Para garantir que os produtos PCR tivessem saliências únicas de adenina de três extremidades para clonagem de TA na etapa seguinte, recomenda-se uma extensão de 30 minutos a 72 graus centígrados após o último ciclo. Verifique o produto PCR por eletroforese de gel agarose. Se o fragmento foi amplificado corretamente, uma banda de 717 bp pode ser observada no gel.
Clone o produto PCR no vetor pET SUMO usando o método de clonagem TA com ligase de DNA T4. Incubar a reação à temperatura ambiente por 30 minutos. Adicione cinco microliter de produto PCR em 100 microliter de células competentes BL21.
Choque térmico das células a 42 graus centígrado por 90 segundos, em seguida, manter a mistura no gelo por três minutos. Adicione 400 microliter de meio LB, pré-aquecido a 37 graus centígrados. Balançando uma hora a 37 graus centígrados e 120 rpm.
Inocular a bactéria na superfície da placa LB com 100 microgramas por mililitro kanamycin para testar o E.coli transformado em vetor. Incubar a placa no forno centigres de 37 graus durante a noite. No dia seguinte, inocular uma colônia positiva em cinco mililitros de mídia LB com 100 microgramas por mililitro kanamycin.
Incubar na incubadora de centígres de 37 graus a tremer a 120 rpm por duas horas. Em seguida, adicione a lactose indutor a uma concentração final de 0,5 milimole por litro e continue tremendo seis horas, induzindo a expressão EGFP. Empiricamente, ao tremer seis horas, o OD600 pode chegar a 0,7 ou mais.
Finalmente, utilizando microscópio de fluorescência para verificar a extensão da expressão EGFP. Adicione 10 microliter do meio de cultura bacteriana a um slide. Em seguida, cubra com um deslizamento de cobertura.
Examine a expressão de EGFP sob o microscópio de fluorescência. Adicione 3,5 gramas de tioglicolato em 100 mililitros de água destilada. Esterilize em autoclave antes de usar.
Aspire o meio de tioglicolato na seringa estéril de um mililitro no capô. Um rato por seringa para evitar a infecção. Injete um mililitro de 3,5% de thioglycollate médio na cavidade peritoneal do camundongo usando uma agulha de calibre 23 e mantenha o rato com água e ad libitum alimentar por três dias.
Após três dias, eutanize o rato por deslocamento cervical depois de induzir rapidamente anestesia por sevoflurano em uma caixa fechada. Em seguida, coloque o mouse em um prato com 75% de etanol para estéril e transfira para o capô rapidamente. Coloque o mouse na placa e fixe a pata dianteira na placa para fixar a posição do mouse.
Usando uma seringa de cinco mililitros com uma agulha de calibre 20, injete cinco mililitros de PBS frio no abdômen inferior na cavidade peritoneal do rato, evitando perfurar o intestino. Faça uma massagem suave em dois lados do abdômen do rato. Em seguida, aspire o fluido abdominal suavemente e lentamente.
Distribua o fluido peritoneal em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Repita esses passos duas ou três vezes. Centrifugar as células suspensas por 10 minutos a 400 g em quatro a oito centígradas.
Descarte o supernasal e resuspenque a pelota celular em meio RPMI 1640 com soro bovino fetal de 10%. Adicione cinco milhões de células em cada poço da placa de seis poços para o ensaio de citometria de fluxo e 500.000 células por poço em uma placa de 24 poços para microscópio de fluorescência. Cultura as células a 37 graus centígrado em uma incubadora de dióxido de carbono 5% durante a noite.
O meio de cultura pode ser atualizado após três horas para remover células não aadeentes porque a maioria delas eram linfócitos. Observe as células sob um microscópio de campo brilhante para avaliar a viabilidade celular e a densidade celular. A imagem mostrada aqui estava em condições normais da célula primária.
Normalmente, a densidade das células macrófagos não era alta, porque grande parte das células peritoneais eram linfócitos. Remova o meio de cultura da placa de 24 poços. Adicione 100 microliter de cultura fresca média e 10 microliter de meio bacteriano.
Em seguida, incubar a placa a 37 graus centígrado em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% por uma hora. Lave suavemente com 500 microliter de PBS frio por poço três a cinco vezes para lavar bactérias não internalizadas. Incubar as células com 4% de formaldeído em PBS à temperatura ambiente por 30 minutos.
Lave as células com PBS três vezes. Adicione a solução de trabalho conjugal 633 conjugada para manchar f-actin. Guarde em um lugar escuro e úmido à temperatura ambiente por 60 minutos.
Adicione a solução de trabalho DAPI para manchar a célula nuclear e incubar por cinco minutos em um lugar escuro à temperatura ambiente. Enxágüe uma vez com PBS e uma vez com o mesmo volume em água destilada. O EGFP-expressing E.coli exibido em verde serviu como marcador de fagocitose.
Para minimizar erros experimentais e fazer a interpretação adequada dos resultados, defina grupos e tubos de controle para o experimento conforme listado na Tabela 2. Para o grupo controle que será colocado no gelo, remova o meio da placa de seis poços e lave com PBS uma vez. Em seguida, adicione 70 milimole por litro frio EDTA um mililitro no poço para desapegar as células e transferir para o tubo de citometria de fluxo.
Adicione 50 microliter de suspensão bacteriana no tubo e coloque-o no gelo por uma hora. Para os outros grupos, remova o meio de cultura, adicione um mililitro fresco em cada poço. Adicione 50 microliter de suspensão de bactérias nos poços de acordo com a configuração do grupo, conforme descrito na tabela dois.
Em seguida, coloque a placa de seis poços na incubadora centígrada de 37 graus de 5% de dióxido de carbono por uma hora. Para saciar a fluorescência de E.coli não internalizado, adicione 200 microliter de 0,8% de solução de água violeta cristalina no poço e balance em breve. Esta etapa visava evitar o resultado falso positivo pela ligação E.coli EGFP à superfície dos macrófagos, mas não internalizada.
Lave as células com PBS três vezes para remover qualquer violeta residual. Em seguida, adicione 70 milimole por litro frio EDTA um mililitro no poço para desapegar as células e transferir para o tubo de citometria de fluxo. Centrifugar os tubos 2.000 rpm cinco minutos e descartar o supernasal.
Adicione 100 microliter de PBS para resuspensar as células. Adicione cinco microliter de anticorpo conjugado ATP F4 nos tubos ou isótipo de acordo com a configuração do grupo. Vórtice brevemente e incubar as amostras no gelo por cinco a 10 minutos no escuro.
Adicione um PBS mililitro em cada tubo e centrífuga 2.000 rpm cinco minutos. Descarte o supernaspeso. Resuspense as pelotas celulares com 200 a 300 microliter de PBS para análise de citometria de fluxo.
Execute cada tubo e adquira dados para pelo menos 10.000 eventos de células F4/80 positivas. Aqui estão as imagens de fluorescência de macrófagos peritoneais dos grupos jovens e idosos. A fluorescência vermelha representa f-actin.
O verde representa e.coli expressante e.coli, e o azul representa núcleo manchado pelo DAPI. Essas imagens sugerem que os macrófagos do camundongo jovem tinham uma habilidade fagocítica mais forte do que os do rato envelhecido. As células F4/80 positivos e EGFP-positivo indicaram a capacidade fagocítica dos macrófagos.
Esses resultados são consistentes com a tendência dos resultados do microscópio de fluorescência. Bem, veja, embora o número de células imunes inatas possa ser preservado em camundongos envelhecidos, a habilidade fagocítica diminuiu significativamente em comparação com o camundongo jovem. Muitos métodos têm sido empregados para avaliar a fagocitose macrófago.
Aqui demonstramos um método aprimorado que seja conveniente, rápido e economicamente viável. Com egfp expressando E.coli, um ensaio de fagocitose pode ser facilmente realizado e medido tanto pelo citómetro de fluxo quanto pelo microscópio fluorescente, de acordo com as preferências do pesquisador. Além disso, este método mede diretamente a capacidade fagocítica.
Os resultados são mais reprodutíveis do que outros métodos indiretos.
