Dieses Protokoll zeigte eine einfache und produzierbare Methode zur Beurteilung der Phagozytosefähigkeit von Makrophagen mit EGFP-exekomsochierender Escherichia coli. Hallo, mein Name ist Jun-Yu vom Zweiten Krankenhaus der Dalian Medical University. Heute werden wir Ihnen eine einfache zeigen und visualisieren die Art und Weise, Makrophage Phagozytose zu bewerten, die leicht innerhalb von zwei Stunden getan werden kann.
Diese Methode wurde häufig in der Studie der angeborenen Immunfunktion verwendet. Es wird angenommen, dass angeborene Immunfunktion bei älteren Menschen intakt blieb. Heute werden wir also die peritonealen Makrophagen von den alten und jungen Mäusen isolieren und die phagozytische Fähigkeit dieser beiden Gruppen sehen.
Nun, lassen Sie uns beginnen. Erstens, synthetisieren Sie das EGFP-Genfragment und klonen Sie das Fragment mit High-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase. Dann ligate das PCR-Produkt in den pET SUMO-Vektor.
Drittens: Umwandlung der Ligationsprodukte in den E.coli-Stamm und Induzieren EGFP-Exzess mit Laktose. Diese EGFP-exemitzenden E.coli dienten als Marker für den Phagozytose-Assay. Als nächstes wurden eine MausperitoneumMakrophagen isoliert und kultiviert.
Dann wurden EGFP-exezierende E.coli mit den Makrophagen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius geprägt. Nach dem Löschschritt waren die Makrophagen sowohl mit dem Fluoreszenzmikroskop als auch mit dem Durchflusszytometer zur Bewertung bereit. Synthetisieren Sie das EGFP-Genfragment und verstärken Sie das Fragment mit einer Vorwärts- und Reverse-Primer mit High-Fidelity-Taq-DNA-Polymerase.
Um sicherzustellen, dass die PCR-Produkte im nächsten Schritt über einzelne Drei-End-Adeninüberhänge für das TA-Klonen verfügen, wird eine 30-minütige Verlängerung bei 72 Grad Celsius nach dem letzten Zyklus empfohlen. Überprüfen Sie das PCR-Produkt durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Wenn das Fragment richtig verstärkt wurde, kann ein 717 bp Band auf dem Gel beobachtet werden.
Klonen Sie das PCR-Produkt in den pET SUMO-Vektor mit der TA-Klonmethode mit T4-DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Fügen Sie fünf Mikroliter PCR-Produkt in 100 Mikroliter BL21 kompetente Zellen.
Hitze schockieren die Zellen bei 42 Grad Zenigre für 90 Sekunden, dann halten Sie die Mischung auf Eis für drei Minuten. Fügen Sie 400 Mikroliter LB Medium, vorgewärmt bei 37 Grad Celsius. Schütteln eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 120 Rpm.
Impfen Sie die Bakterien auf die Oberfläche der LB-Platte mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin, um den vektortransformierten E.coli zu untersuchen. Inkubieren Sie die Platte im 37 Grad Centigrees Ofen über Nacht. Am nächsten Tag impfen Sie eine positive Kolonie in fünf Milliliter LB-Medien mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin.
Inkubieren Sie im 37 Grad Zentigraner Schütteltinkubator bei 120 Rpm für zwei Stunden. Dann fügen Sie den Induktor Lactose zu einer endlichen Konzentration von 0,5 Millimole pro Liter und weiterhin sechs Stunden schütteln, was EGFP-Expression induziert. Empirisch kann der OD600 beim Schütteln sechs Stunden 0,7 oder höher erreichen.
Schließlich mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskops, um das Ausmaß der EGFP-Exzesszugung zu überprüfen. 10 Mikroliter des Bakteriellen Kulturmediums zu einer Folie hinzufügen. Dann mit einem Deckelzettel abdecken.
Untersuchen Sie die Expression von EGFP unter dem Fluoreszenzmikroskop. 3,5 Gramm Thioglycolat in 100 Milliliter destilliertes Wasser geben. Sterilisieren Sie im Autoklaven vor der Verwendung.
Das Thioglycolatmedium in die ein Milliliter sterile Spritze in der Haube aspirieren. Eine Maus pro Spritze, um die Infektion zu vermeiden. Injizieren Sie einen Milliliter 3,5% Thioglycolatmedium in die Peritonealhöhle der Maus mit einer 23-Spur-Nadel und halten Sie die Maus mit Wasser und Nahrung ad libitum für drei Tage.
Nach drei Tagen, euthanisieren Sie die Maus durch Zervixdislokation nach schnell induzieren Anästhesie durch Sevofluran in einem geschlossenen Kasten. Dann legen Sie die Maus in eine Schüssel mit 75% Ethanol steril und schnell in die Haube übertragen. Legen Sie die Maus auf die Platte und heften Sie die Vorderpfote auf das Brett, um die Mausposition zu fixieren.
Mit einer Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 20-Spur-Nadel, injizieren Fünf Milliliter kalte PBS am unteren Bauch in die Peritonealhöhle der Maus, um zu vermeiden, den Darm zu durchdringen. Führen Sie eine sanfte Massage auf zwei Seiten des Mausbauchs durch. Dann die Bauchflüssigkeit sanft und langsam ansaugen.
Geben Sie die Peritonealflüssigkeit in ein 50-Milliliter-Zenrichreöhre. Wiederholen Sie diese Schritte zwei- oder dreimal. Zentrifugieren Sie die suspendierten Zellen für 10 Minuten bei 400 g in vier bis acht Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in RPMI 1640 medium mit 10% fetalem Rinderserum wieder auf. Fügen Sie fünf Millionen Zellen in jeden Brunnen der Sechs-Brunnen-Platte für den Durchflusszytometrie-Assay und 500.000 Zellen pro Well in eine 24-Well-Platte für das Fluoreszenzmikroskop ein. Kultur die Zellen bei 37 Grad Zenigrees in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht.
Das Kulturmedium kann nach drei Stunden erfrischt werden, um nicht haftende Zellen zu entfernen, da die meisten davon Lymphozyten waren. Beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtfeldmikroskop, um die Zelllebensfähigkeit und Zelldichte zu bewerten. Das hier gezeigte Bild befand sich im normalen Zustand der Primärzelle.
Normalerweise war die Makrophagenzelldichte nicht hoch, da ein Großteil der Peritonealzellen Lymphozyten waren. Entfernen Sie das Kulturmedium von der 24-Well-Platte. Fügen Sie 100 Mikroliter frisches Kulturmedium und 10 Mikroliter bakterielles Medium hinzu.
Dann inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Zenigrees in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator für eine Stunde. Mit 500 Mikroliter kaltem PBS pro Brunnen drei- bis fünfmal sanft waschen, um nicht-internalisierte Bakterien auszuwaschen. Inkubieren Sie die Zellen mit 4%Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Phalloidin 633 konjugieren arbeitslösung hinzufügen, um F-Actin zu färben. 60 Minuten an einem dunklen, feuchten Ort bei Raumtemperatur aufbewahren.
Fügen Sie die DAPI-Arbeitslösung hinzu, um die Zelle kernnuklear zu färben und fünf Minuten lang an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur zu brüten. Einmal mit PBS und einmal mit der gleichen Menge in destilliertem Wasser abspülen. Die EGFP-exemitende E.coli in grün dargestellt diente als Marker der Phagozytose.
Um experimentelle Fehler zu minimieren und die Ergebnisse richtig zu interpretieren, legen Sie Gruppen und Steuerrohre für das Experiment fest, wie in Tabelle 2 aufgeführt. Für die Kontrollgruppe, die auf das Eis gelegt wird, entfernen Sie das Medium von der Sechs-Brunnen-Platte und waschen Sie es einmal mit PBS. Dann fügen Sie 70 Millimole pro Liter kalte EDTA einen Milliliter in den Brunnen, um die Zellen zu lösen und in den Durchfluss Zytometrierohr übertragen.
50 Mikroliter bakterielle Suspension in die Röhre geben und eine Stunde lang auf das Eis legen. Für die anderen Gruppen, entfernen Sie das Kulturmedium, fügen Sie jeweils einen Milliliter frisches Medium in jeden Brunnen. Fügen Sie 50 Mikroliter Bakteriensuspension in die Brunnen nach der Gruppeneinstellung, wie in Tabelle 2 beschrieben.
Dann legen Sie die Sechs-Well-Platte in den 37 Grad Zentiären 5% Kohlendioxid-Inkubator für eine Stunde. Um die Fluoreszenz von nicht-internalisiertem E.coli zu löschen, fügen Sie 200 Mikroliter 0,8% kristallviolette Wasserlösung in den Brunnen und schwanken sie kurz. Dieser Schritt zielte darauf ab, falsch positive Ergebnisse durch die EGFP E.coli Bindung an die Oberfläche der Makrophagen zu vermeiden, aber nicht internalisiert.
Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um Restkristallviolett zu entfernen. Dann fügen Sie 70 Millimole pro Liter kalte EDTA einen Milliliter in den Brunnen, um die Zellen zu lösen und in den Durchfluss Zytometrierohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Rohre 2.000 U/min fünf Minuten und entsorgen Sie den Überstand.
Fügen Sie 100 Mikroliter PBS hinzu, um die Zellen wieder auszusetzen. Fügen Sie fünf Mikroliter F4 ATP konjugierten Antikörper in die Rohre oder Isotyp entsprechend der Gruppeneinstellung. Wirbel kurz und inkubieren die Proben auf Eis für fünf bis zehn Minuten im Dunkeln.
Fügen Sie eine Milliliter PBS in jedes Rohr und Zentrifuge 2 000 U/min fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellpellets mit 200 bis 300 Mikroliter PBS für die Durchflusszytometrieanalyse wieder aus.
Führen Sie jede Röhre aus und erfassen Sie Daten für mindestens 10.000 Ereignisse von F4/80-positiven Zellen. Hier sind die Fluoreszenzbilder von peritonealen Makrophagen aus jungen und älteren Gruppen. Die rote Fluoreszenz steht für F-Actin.
Das Grün steht für EGFP-exemittierte E.coli, und das Blau steht für den von DAPI gebeizten Kern. Diese Bilder deuten darauf hin, dass Makrophagen der jungen Maus eine stärkere phagozytische Fähigkeit hatten als die von der gealterten Maus. Die F4/80-positiven und EGFP-positiven Zellen zeigten die phagozytische Fähigkeit der Makrophagen an.
Diese Ergebnisse stimmen mit dem Trend der Fluoreszenzmikroskop-Ergebnisse überein. Nun, Sie sehen, obwohl die Anzahl der angeborenen Immunzellen bei alter Maus erhalten bleiben kann, verringerte sich die phagozytische Fähigkeit signifikant im Vergleich zur jungen Maus. Viele Methoden wurden verwendet, um Makrophagenphagozytose zu bewerten.
Hier zeigen wir eine verbesserte Methode, die bequem, schnell und wirtschaftlich machbar ist. Mit EGFP-exezierendem E.coli kann ein Phagozytose-Assay leicht mit durchFlusszytometer und Fluoreszenzmikroskop nach den Vorlieben des Forschers durchgeführt und gemessen werden. Auch diese Methode misst direkt die phagozytische Fähigkeit.
Die Ergebnisse sind reproduzierbarer als andere indirekte Methoden.
