Hemos demostrado que los genomas virales del grupo IV codifican tramos cortos de secuencias de proteínas huésped. Estas secuencias se pueden encontrar dentro de los sitios de escisión de proteasa viral. Se están utilizando para la destrucción dirigida de proteínas huésped, típicamente proteínas implicadas en la generación de las respuestas inmunitarias.
Una de las principales ventajas de utilizar ensayos de proteasa es que elimina la complejidad de una célula y muestra si una proteasa viral puede cortar o no una secuencia en particular. Así que cuando analizamos las secuencias SSHHPS de Zika, descubrimos que la proteasa podía cortar secuencias en proteínas involucradas en la generación de respuestas inmunitarias y que algunas de estas proteínas también tenían funciones en el desarrollo del cerebro y los ojos. Al realizar esta técnica por primera vez, hay que recordar que si no se observa escisión, que puede deberse a una variedad de factores como la actividad de la proteasa.
Demostrando el procedimiento estará Jaimee Compton, un técnico de mi laboratorio. Comience abriendo Protein BLAST y coloque los 20 aminoácidos que rodean el enlace de la scisile y la poliproteína viral y seleccione secuencias de proteínas no redundantes y escriba en el genoma del huésped que se buscará. Si es necesario, seleccione PHI-BLAST y escriba una secuencia de patrones donde los corchetes indiquen que cualquiera de los aminoácidos dentro de los corchetes puede estar en la posición de suplente y, a continuación, pulse BLAST.
Ordene el orden de los hits BLAST en función del número de residuos idénticos o tolerados consecutivos que coincidan con una secuencia de sitio de escote. En la lista, seleccione las proteínas que contengan seis o más residuos idénticos o similares para su análisis en los ensayos de proteasa. Construir un plásmido que codifica la proteína fluorescente cian, hasta 25 aminoácidos de la secuencia de escote, y la proteína fluorescente amarilla.
A continuación, prepare los sustratos CFP y YFP inoculando cuatro matraces de cuatro litros con 25 mililitros de un cultivo nocturno. Agitar los cultivos a 37 grados centígrados y monitorear el crecimiento cada hora por espectroscopia UV-Vis a 600 nanómetros. Cuando las bacterias alcancen una absorbancia de aproximadamente uno, induzca la expresión de proteínas añadiendo 0,5 mililitros de un IPTG molar a cada matraz, luego reduzca la temperatura de la incubadora de temblores a 17 grados centígrados y permita que la expresión continúe durante la noche durante 17 a 20 horas.
Al día siguiente, peletiza las bacterias por centrifugación a 7000 veces g durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Retire y deseche el medio líquido y luego almacene los pellets a menos 80 grados Centígrados o proceda con la lelisis celular. Para la persecia de las células, prepare 100 mililitros de tampón de lelisis de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, resuspendir los pellets en el tampón y transferir de 25 a 25 mililitros de la suspensión a tubos cónicos desechables de 50 mililitros.
Coloque los tubos en un vaso de precipitados de plástico con agua helada y luego inserte la punta del sonicador en el tubo de modo que la punta esté a un centímetro de la parte inferior del tubo y sonice el lisato de 10 a 20 veces hasta que se vuelva fluido y licuado. Después de la sonicación, transfiera el izado a los tubos centrífugos de alta velocidad y centrifugarlo a 20, 500 x g durante 30 minutos a 4 grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a una botella limpia y deseche los pellets.
Cargue el izado en la columna de níquel y luego lave la columna con dos volúmenes de columna del búfer A seguidos de cinco volúmenes de columna de 20%buffer B.La absorción a 280 nanómetros aumentará durante el lavado a medida que los contaminantes se eluen de la columna. Continúe lavando hasta que A280 vuelva a los valores de línea base. A continuación, eluda la proteína con volúmenes de dos a tres columnas de 100%buffer B y recoger fracciones de 10 mililitros, asegurándose de medir el A280 de cada fracción.
Preparar ocho mezclas de reacciones de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y pipeta 45 microlitros de cada mezcla en los tres primeros pozos de cada fila de una placa negra de media área de 96 pozos. Configure el lector de placas para la detección simultánea de florescencia en dos longitudes de onda con un ajuste de tubo fotomultiplicador fijo. Programe el tiempo de lectura de 20 a 30 minutos con una lectura por minuto y seleccione los pozos que desea leer.
Inserte la placa en la máquina e inicie la lectura, monitoreando las relaciones de emisión a lo largo del tiempo. Ejecute una lectura de punto final de la placa que contiene el sustrato sin cortar. Retire la placa y la pipeta cinco microlitros de enzimas en cada pozo.
Se puede guardar la primera columna como un control sin cortar. A continuación, vuelva a leer la placa durante 20 a 30 minutos, asegurándose de ajustar el lector de placas a los valores absolutos de salida. Una vez finalizada la lectura, selle la placa con película para evitar la evaporación y déjela durante la noche a temperatura ambiente para permitir que la enzima corte completamente el sustrato.
Después de 24 horas, retire la película y realice una lectura final de la placa. Promediar las relaciones de emisión y registrarlas como cortadas. Confirme el escote del sustrato utilizando SDS-PAGE.
Cargue un marcador de peso molecular en el primer o último carril y cargue cinco microlitros de cada mezcla de reacción en un carril del gel, comenzando con la reacción sin cortar. Conecte los electrodos del depósito de gel a la fuente de alimentación y ejecute los productos a 110 voltios durante 60 minutos. Retire el gel del cassette con una herramienta de agrietamiento y sumerjalo en cinco a 10 mililitros de solución de tinción.
Después de una a 24 horas, retire el exceso de manchas y sumerja el gel en agua. A continuación, tome una foto del gel con un gel imager. Para preparar la estructura proteica, cargue el archivo PDB de proteína en MOE.
Haga clic en Seleccionar y disolvente y, a continuación, elimine el disolvente. Abra el panel Estructura pPreparación en la barra de menús superior Calcular y corrija automáticamente todos los elementos estructurales haciendo clic en Corregir. Protonar la estructura haciendo clic Protonar 3D.
Agregue cargas parciales a la proteína abriendo el panel Cargas parciales y seleccionando AMBER 99 y Ajustar hidrógenos y pares solitarios según sea necesario. A continuación, guarde el archivo de estructura. Para construir la estructura de los péptidos de sustrato y TRIM14, abra el panel Creador de proteínas, introduzca la secuencia de sustrato y seleccione Reempaque automático.
A continuación, establezca Geometría como Extendida y haga clic en Generar. Finalmente minimice la estructura y guárdela como un archivo PDB. Acote los péptidos de sustrato a VEEV-nsP2 utilizando el software PyRx AudoDock 4.2.
Cargue la proteína, haga clic con el botón derecho en el nombre y seleccione Crear macromolécula para preparar el archivo de acoplamiento PDBQT. A continuación, cargue la molécula de sustrato y seleccione Hacer ligando para preparar el archivo de acoplamiento de ligando. Inicie el asistente AutoDock en el panel de acoplamiento de la parte inferior y seleccione los archivos de ligando y proteínas preparados.
Defina el bolsillo de unión a proteínas ajustando manualmente la dimensión de la cuadrícula y, a continuación, ejecute AuotGrid. A continuación, ejecute AutoDock y seleccione el método de algoritmo genético lamarckian. Haga clic en Parámetros de acoplamiento y establezca el número de ejecuciones de GA en 50 y, a continuación, haga clic en Reenviar para iniciar la ejecución de acoplamiento.
Cuando AutoDock esté completo, abra el panel Analizar resultados e inspeccione todas las posturas de encuadernación previstas. Seleccione el mejor modelo con la energía de unión pronosticada más baja e interacciones de unión razonables entre el cis-477 y el sustrato en el sitio de escisión y, a continuación, guárdelo como un archivo PDB para más simulaciones MD. Después de leer las posturas de encuadernación con AutoDock, es importante realizar análisis posteriores al acoplamiento para identificar el modelo de encuadernación plausible para el refinamiento con simulaciones MD.
Este protocolo se utilizó para encontrar tramos cortos de secuencias de proteínas homógenas del huésped o SSHHPS en la proteasa del virus del Zika ns2B/3. Se identificaron cuatro dianas de proteína huésped. FOXGS, SFRP1, una subunidad Gsalpha de una biblioteca de ADNc de retina, y la mitocondrial NT5M 5'3'nucleotidasa.
Las alineaciones de secuencia del SSHHPS permitieron diferencias específicas de especies en las secuencias de sitio de escisión. La secuencia SFRP1 fue idéntica en humanos y pollos, lo que es digno de mención porque el virus del Zika puede inducir mortalidad y microcefalia en embriones de pollo. El ensayo continuo se utilizó para medir los parámetros cinéticos en estado estacionario y las constantes de inhibición de las secuencias de poliproteínas virales y el ensayo discontinuo se utilizó para obtener información de escisión cualitativa, como el escote de una secuencia particular o la inhibición de la proteasa por varios compuestos.
Se hizo un modelo de la unión de la encefalitis equina venezolana nsP1-nsP2 utilizando métodos silico. Para la proteasa nsP2, alargar la secuencia de sustrato y reducir la resistencia iónica del tampón condujo a una reducción significativa en la constante Michaelis de escisión de una secuencia de virus del bosque de Semliki. Al intentar este procedimiento, es importante ejecutar los controles.
Los sustratos que contienen las secuencias de sitio de escisión de proteasa viral deben probarse antes de proceder con el análisis de secuencia SSHHPS. Si se observa escisión de una proteína huésped, se deben llevar a cabo experimentos de seguimiento para confirmar que esa proteína huésped afecta la replicación viral. Esto se puede hacer sobreexpresando o silenciando la proteína, y luego examinando los efectos sobre la replicación viral.
El grupo IV contiene un gran número de patógenos nuevos y emergentes. Las secuencias SSHHPS vinculan proteínas y vías específicas del huésped con las proteasas virales de una manera muy predecible.
