Este protocolo permite a los investigadores generar virus pseudotipo que se pueden utilizar de forma segura para estudiar eventos de entrada virales de virus altamente patógenos, como el coronavirus sal y la mayoría del coronavirus. Esta técnica versátil se basa en la fácil configuración de la transfección transitoria. Este sistema también se puede aplicar para producir partículas pseudotipo con proteínas de fusión de otros virus, no sólo coronavirus S.Para obtener mejores resultados es importante controlar la salud y densidad celular para la transfección, así como para la infección por el virus pseudotipo.
Demostrar este procedimiento serán Tiffany Tang y Lakshmi Nathan. Estudiantes graduados de mi laboratorio. Para comenzar, lave cuidadosamente las células HEK293T con 10 mililitros de 37 grados Celsius, DPBS precalentados dos veces.
A continuación, aspirar el sobrenadante y unir células con un mililitro de solución de 25% de trippsina que se ha precalentado a 37 grados centígrados. Que, incubar el matraz de células a 37 grados Celsius en un 5% de medio ambiente de dióxido de carbono durante tres a cinco minutos hasta que las células comiencen a desprendirse. Agregue cuatro mililitros de DMEM completo para desactivar la solución de trypsin.
Y luego contar las células usando una diapositiva de conteo celular y un microscopio de luz. Diluir las células a 500.000 células por mililitro con DMEM completo. A continuación, semilla de dos mililitros por pozo de la solución celular en una placa de cultivo de tejido de 6 pozos.
Y mueva suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente las células. Después de asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente incubar la placa a 37 grados Celsius y 5%ambiente de dióxido de carbono durante la noche o 16 a 18 horas. Para preformar tres plásmidos de cotransfección, primero mezcle los volúmenes calculados de plásmidos y el medio de cultivo de células séricas reducidas en un tubo de micro centrífuga.
Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, añada tres microlitros por poero del reactivo de transfección a base de lípidos a 47 microlitros por pozo del medio de cultivo de células séricas reducida. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, en un tubo de micro centrífuga, mezcle cantidades iguales del reactivo de transfección y las soluciones de plásmido por tubería que se dirige hacia arriba y hacia abajo varias veces. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de la incubación nocturna de la placa celular, utilice un microscopio de luz invertido para examinar las células en busca de morfología y densidad.
Luego, aspirar el medio gastado de las células y añadir suavemente un mililitro por pozo del medio de cultivo de células séricas reducida precalentó a cada pozo. A continuación, agregue 100 microlitros de la solución de transfección a cada pozo de caída sabia. E incubar las células a 37 grados centígrados en 5% de dióxido de carbono durante cuatro a seis horas.
Al final de la incubación, añadir un mililitro de transfección libre de antibióticos precalentó DMEM, a 37 grados centígrados a cada pocidio. E incubar las células a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono durante 48 horas. Para comenzar la recolección de partículas pseudotipo, utilice un microscopio de luz invertido para examinar las células para su morfología y condición general.
El color del medio debe ser de color rosa claro o ligeramente naranja. Luego, transfiera los sobrenadantes de las células trans infectadas a 50 tubos de centrífugo cónicos de 50 mililitros. Centrifugar los tubos a 290 veces la gravedad durante siete minutos para eliminar los desechos celulares.
A continuación, filtro clarificado sobrenadante a través de un filtro estéril de 0,45 micras tamaño de poro. Haga alícuotas de pequeño volumen de solución de virus pseudotipo en viales criogénicas. Y guárdalos en 80 grados Celsius negativos.
Para realizar la infección por partículas pseudotipadas, primero examen de células bajo microscopio de luz para confirmar que hay una alfombra confluente de células. Luego, lave las células tres veces con 0,5 mililitros de los DPBS precalegados a 37 grados centígrados. A continuación, aspirar los sobrenadantes de las células e inocular las células con 200 microlitros de la solución de partículas pseudotipadas descongeladas.
Incubar las células a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono durante una o dos horas. Después del período de incubación, agregue 300 microlitros del DMEMc precalentó a 37 grados centígrados. E incubar las células infectadas a 37 grados centígrados en 5% de dióxido de carbono durante 72 horas.
Finalmente aspirar los sobrenadantes de las células infectadas. Y preceder al ensayo de reportero de Luciferase. Para cuantificar la infectividad de las partículas pseudotipadas primero descongelar el sustrato de luciferina, almacenado en menos 80 grados Celsius, a la vez cinco veces el búfer de lysis del ensayo luciferase almacenado a menos 20 grados Celsius a temperatura ambiente.
Luego, diluir el tampón de lysis del ensayo luciferasa a una vez concentración con agua estéril. A continuación, añada 100 microlitros del tampón diluido a cada pozo. E incubar a temperatura ambiente en un balancín durante 15 minutos.
Para realizar la medición de la actividad de la luciferasa, uno a la vez, primero agregue 20 microlitros de sustrato de luciferina a un tubo de micro centrífuga. A continuación, agregue 10 microlitros del izado al tubo. Mezcle el contenido moviendo suavemente los tubos.
Y colocó el tubo en un dispositivo luminómetro. Cierre la tapa y mida el valor de luminiscencia del tubo. Registre la medición de las unidades de luz relativas y preceda al análisis de datos.
Los ensayos de infectividad de SARS-Spp y MERS-Spp en células huésped susceptibles mostraron una fuerte infectividad media, en comparación con las partículas de control positivas esperadas. Controles no infectados y las partículas de control negativas que carecen de glicoproteínas de envolvente viral. También los ensayos de actividad de la luciferasa mostraron dependencia de la concentración de infectividad SARS-Spp y MERS-Spp.
Un aumento de la infectividad SARS-Spp o MERS-Spp en células diana poco permisivas, transfectadas para el receptor ACE2 expreso de SARS-Spp, o el receptor DPP4 de MERS-Spp, confirma que el uso del receptor de pseudoviriones es similar al de los virus nato para mediar la unión y la entrada de pseudoviriones. Compruebe dos veces los cálculos antes de realizar este paso. Y asegúrese de que todas las soluciones se mezclan bien durante el paso.
Se puede realizar un ensayo de manchas occidentales en partículas pseudotipadas concentradas para evaluar la incorporación de glicoproteína S en los pseudoviriones. Mientras que las partículas pseudotipadas descritas aquí son sustitutos más seguros que los virus nato, todavía requieren precauciones de nivel dos de bioseguridad.
