Bu protokol, araştırmacıların sal coronavirus ve en coronavirus gibi yüksek patojenik virüslerin viral giriş olaylarını incelemek için güvenle kullanılabilecek psödotip virüsleri üretmesine olanak tanır. Bu çok yönlü teknik, kolay kurulum geçici geçici dayanmaktadır. Bu sistem aynı zamanda diğer virüslerin füzyon proteinleri ile psödotiplenmiş parçacıklar üretmek için uygulanabilir, sadece coronavirus S.For en iyi sonuçlar için hücre sağlığı ve transfeksiyon için yoğunluğu izlemek için önemlidir yanı sıra psödotipi virüs enfeksiyonu için.
Bu prosedürü gösteren Tiffany Tang ve Lakshmi Nathan olacaktır. Laboratuvarımdan mezun öğrenciler. Başlamak için, HEK293T hücrelerini 10 mililitre 37 santigrat derece ile dikkatlice yıkayın, dpbs önceden ısıtılmış iki kez.
Daha sonra, supernatant aspire ve 37 santigrat derece önceden ısıtılmış olan% 25 tripsin çözeltisi bir mililitre ile hücreleri eklemek. Daha, hücreler ayrışmaya başlayana kadar 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ortamında hücrelerin şişe kuluçka. Trypsin çözeltisini devre dışı bırakmak için dört mililitre tam DMEM ekleyin.
Ve sonra hücreleri bir hücre sayma slayt ve ışık mikroskobu kullanarak saymak. Hücreleri mililitrede 500,000 hücreye seyreltin. Sonra, 6-iyi doku kültür plaka hücre çözeltisi kuyu başına iki mililitre tohum.
Ve yavaşça hücreleri eşit dağıtmak için plakayı ileri geri ve yan lara doğru hareket ettirin. Hücrelerin eşit olarak 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit çevre gecede veya 16-18 saat olarak plaka kuluçka dağıtıldıktan sonra. Üç plazmid kotransfeksiyonp reform için, ilk mix plazmidler ve mikro santrifüj tüp azaltılmış serum hücre kültürü orta hacimleri hesaplanır.
Karışımı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra lipid bazlı transfeksiyon reaktifinin her biri için üç mikrolitre ekleyin ve azaltılmış serum hücre kültürü ortamının 47 mikrolitresini ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, bir mikro santrifüj tüpünde, transfeksiyon reaktifinin eşit miktarda ve plazmid çözeltilerini birkaç kez yukarı ve aşağı boru ile karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre plakasının bir gecede kuluçkaya yatmasını sonra, hücreleri morfolojileri ve yoğunlukları için incelemek için ters ışık mikroskobu kullanın.
Daha sonra, hücrelerin harcanan orta aspire ve yavaşça her kuyu için önceden ısıtılmış azaltılmış serum hücre kültürü orta kuyu başına bir mililitre ekleyin. Daha sonra, her iyi damla akıllıca transfection çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin. Ve hücreleri 37 derecede %5 karbondioksitle 4-6 saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, her kuyuya 37 santigrat derecede bir mililitre önceden ısıtılmış antibiyotiksiz transfeksiyon DMEM ekleyin. Ve hücreleri 37 derecede 48 saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Psödotipi parçacıklar toplama başlamak için onların morfolojisi ve genel durumu için hücreleri muayene etmek için ters ışık mikroskobu kullanın.
Orta renk açık pembe veya biraz turuncu olmalıdır. Daha sonra, transfected hücrelerin supernatants 50 mililitre konik santrifüj tüpleri aktarın. Hücre enkazını temizlemek için tüpleri 290 kat yer çekiminde yedi dakika santrifüj edin.
Daha sonra, filtre steril 0,45 mikron gözenek boyutu filtresi ile supernatant açıklık. Cryo şişelerde pseudotype virüs çözeltisi küçük hacimli aliquots olun. Ve onları negatif 80 derecede saklayın.
Psödotipli parçacık enfeksiyonu gerçekleştirmek için, hücrelerin bir confluent halı olduğunu doğrulamak için ışık mikroskobu altında ilk muayene hücreleri. Daha sonra hücreleri 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış DPBS'nin 0,5 mililitresi ile üç kez yıkayın. Daha sonra, hücrelerin süpernatantları aspire ve çözülmüş psödotipli parçacık çözeltisi 200 mikrolitre ile hücreleri aşılamak.
Hücreleri 37 derecede %5 karbondioksitle 1-2 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka döneminden sonra, 37 santigrat derece önceden ısıtılmış DMEMc 300 mikrolitre ekleyin. Ve enfekte hücreleri 72 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Son olarak enfekte hücrelerin supernatants aspire. Ve luciferase muhabir insay öncesinde. Psödotipli parçacıkların enfekteliğini ölçmek için ilk olarak eksi 80 santigrat derecede saklanan luciferin substratı, beş seferde eksi 20 santigrat derecede oda sıcaklığında depolanan luciferase assay lisis tamponu.
Daha sonra, steril su ile bir kez konsantrasyon luciferase assay lysis tampon seyreltin. Daha sonra, her kuyuya seyreltilmiş arabellek 100 mikrolitre ekleyin. Ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir rocker'da kuluçkaya yat.
Luciferase aktivite ölçümü gerçekleştirmek için, bir seferde bir iyi, ilk bir mikro santrifüj tüp için luciferin substrat 20 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, tüp için lysate 10 mikrolitre ekleyin. Tüpleri hafifçe hareket ettirerek içindekileri karıştırın.
Ve tüpü bir luminometre cihazına yerleştirdim. Kapağı kapatın ve tüpün Parlaklık değerini ölçün. Göreli ışık birimleri ölçümünü kaydedin ve veri çözümlemesi öncesinde.
Duyarlı konak hücrelerde SARS-Spp ve MERS-Spp'nin enfekte likitlik tahlilleri, beklenen pozitif kontrol parçacıklarına kıyasla güçlü bir ortalama enfektivite gösterdi. Enfekte olmayan kontroller ve viral zarf glikoproteinlereksik negatif kontrol parçacıkları. Ayrıca luciferase aktivite tahlilleri SARS-Spp ve MERS-Spp enfektivite konsantrasyon bağımlılığı gösterdi.
SARS-Spp veya MERS-Spp enfektivitesinin, SARS-Spp'in ACE2 reseptörü veya MERS-Spp'nin DPP4 reseptörü ile ifade etmek üzere transfece edilmiş, kötü müsamahakar hedef hücrelerde artması, psödoviriyonların reseptör kullanımının psödovirions'a aracılık etmek ve psödovirions'a giriş yapmak için nato virüslerine benzediğini doğrular. Bu adımı gerçekleştirmeden önce hesaplamaları çift kez kontrol edin. Ve adım sırasında tüm çözümlerin iyi karıştırıldığından emin olun.
Batı dayonu, sistravirions içine S glikoprotein dahil değerlendirmek için konsantre psödotipli parçacıklar üzerinde yapılabilir. Burada tanımlanan sözde tiplenmiş parçacıklar NATO virüslerinden daha güvenli suretler olmakla birlikte, yine de biyogüvenlik seviyesi iki önlem gerektirir.
