פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים ליצור וירוסים פסאודוטיפים שניתן להשתמש בהם בבטחה כדי לחקור אירועי כניסה ויראליים של וירוסים פתוגניים מאוד, כגון נגיף הקורונה ורוב נגיף הקורונה. טכניקה רב-תכליתית זו מבוססת על ההתגנות הטרנזיינטית הקלה. מערכת זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לייצר חלקיקים מדומה עם חלבוני היתוך של וירוסים אחרים, לא רק וירוס S.לקבלת התוצאות הטובות ביותר חשוב לפקח על בריאות התא וצפיפות עבור transfection, כמו גם עבור זיהום וירוס פסאודוטיפ.
הדגמת הליך זה יהיה טיפאני טאנג, ולאקשמי נתן. סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לשטוף בזהירות תאי HEK293T עם 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, DPBS מחומם מראש פעמיים.
לאחר מכן, שאפו את התאים העל-טבעיים והצמידו אותם עם מיליליטר אחד של 25% פתרון טריפסין שהתחמם מראש ב-37 מעלות צלזיוס. מ, דגירה הבקבוק של תאים ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני במשך שלוש עד חמש דקות עד התאים מתחילים להתנתק. הוסף ארבעה מיליליטר של DMEM מלא כדי לבטל את הפעלת פתרון טריפסין.
ואז לספור תאים באמצעות שקופית ספירת תאים ומיקרוסקופ אור. לדלל תאים ל 500, 000 תאים למיליליטר עם DMEM מלא. לאחר מכן, זרע שני מיליליטר ל הבאר של פתרון התא בצלחת תרבות רקמות 6-well.
ומזיזים בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה מצד לצד כדי לפזר תאים באופן שווה. לאחר שוודא כי התאים מופצים באופן שווה דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני הסביבה לילה או 16 עד 18 שעות. כדי ליצור מראש שלושה cotransfection פלסמיד, הראשון לערבב כרכים מחושבים של פלסמידים ואת מדיום תרבות תא הסרום מופחת בצינור מיקרו צנטריפוגה.
להחגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיקרוליטרים ל הבאר של רגנט ההמרה מבוסס השומנים ל-47 מיקרוליטרים ל הבאר של מדיום תרבות תאי הסרום המופחת. להחגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
לאחר מכן, בצינור מיקרו צנטריפוגה, מערבבים כמויות שוות של reagent transfection ואת הפתרונות פלסמיד על ידי צינור כותרת למעלה ולמטה מספר פעמים. הדגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר הדגירה הלי לילה של לוח התא, השתמש במיקרוסקופ אור הפוך כדי לבחון תאים עבור המורפולוגיה והצפיפות שלהם.
לאחר מכן, שאפו את המדיום המושקע של התאים והוסיפו בעדינות מיליליטר אחד ל הבאר של מדיום תרבות תאי הסרום המופחתת החם מראש לכל באר. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של פתרון transfection לכל גם טיפה חכם. ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע עד שש שעות.
בסוף הדגירה, מוסיפים מיליליטר אחד של DMEM ללא אנטיביוטיקה מחומם מראש, ב 37 מעלות צלזיוס לכל באר. ותגרור את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני למשך 48 שעות. כדי להתחיל אוסף חלקיקי פסאודוטיפ להשתמש במיקרוסקופ אור הפוך כדי לראות את התאים עבור המורפולוגיה שלהם ומצב כללי.
צבע המדיום צריך להיות ורוד בהיר או כתום מעט. לאחר מכן, להעביר את supernatants של התאים מגולפים ל 50 צינורות צנטריפוגה חרוטית מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות ב 290 פעמים כבידה במשך שבע דקות כדי להסיר פסולת תא.
לאחר מכן, המסנן הבהיר על-טבעי באמצעות מסנן סטרילי בגודל נקבוביות 0.45 מיקרון. הפוך aliquots נפח קטן של פתרון וירוס פסאודוטיפ בקבוקונים cryo. ולאחסן אותם ב 80 מעלות צלזיוס שליליות.
כדי לבצע זיהום חלקיקים מדומה, תאים הבדיקה הראשונה תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר כי יש שטיח confluent של תאים. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר של DPBS מחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את העל-טבעיים של התאים וחסן את התאים עם 200 מיקרוליטרים של תווי החלקיקים הפסאודוטיפיים המופשרים.
דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני במשך שעה עד שעתיים. לאחר תקופת הדגירה, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של DMEMc מחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס. ותדיגר את התאים הנגועים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני למשך 72 שעות.
לבסוף שאף את העל-טבעיים של התאים הנגועים. ולפני ההסתערות של כתבת לוציפראז. כדי לכמת את הזיהום של חלקיקים פסאודוטיפיים הראשון להפשיר מצע לוציפרין, מאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס, בזמן חמש זמן לוציפראז assay מאגר תזה מאוחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, לדלל את מאגר תזה לוציפראז לריכוז פעם אחת עם מים סטריליים. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של המאגר המדולל לכל באר. ו דגירה בטמפרטורת החדר על נדנדה במשך 15 דקות.
כדי לבצע מדידת פעילות לוציפראז, באר אחת בכל פעם, תחילה להוסיף 20 microliters של מצע לוציפרין לצינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של lysate לצינור. מערבבים את התוכן על ידי תנועה עדין של הצינורות.
והניח את הצינור במכשיר לומינומטר. סגור את המכסה ולמדוד את ערך luminescence של הצינור. רשום את מידת יחידות האור היחסיות ולפני ניתוח נתונים.
תווי ההידביקות של SARS-Spp ו- MERS-Spp בתאים מארחים רגישים, הראו דביקות ממוצעת חזקה, בהשוואה לחלקיקי הבקרה החיוביים הצפויים. בקרות לא נגועות וחלקיקי בקרה שליליים חסרים גליקופרוטאינים מעטפה ויראלית. כמו כן, בדיקת פעילות לוציפראז הראתה תלות בריכוז של דביקות SARS-SPP ו- MERS-Spp.
עלייה של SARS-Spp או MERS-Spp להדביק בתאי יעד מתירניים גרועים, מנוגד לבטא קולטן ACE2 של SARS-Spp, או קולטן DPP4 של MERS-Spp, מאשר כי השימוש הקולטן של pseudovirions דומה לזה של וירוסים נאט"ו לתיווך התקשרות וכניסה של pseudovirions. בדוק שוב חישובים לפני ביצוע שלב זה. וודא שכל הפתרונות מעורבבים היטב במהלך השלב.
בדיקת כתם מערבית יכולה להתבצע על חלקיקים פסאודוטיפיים מרוכזים כדי להעריך את שילוב הגליקופרוטאין בפסאודווירוסים. בעוד החלקיקים המדויפים המתוארים כאן הם תחליפים בטוחים יותר מאשר וירוסי נאט"ו, הם עדיין דורשים אבטחה ביולוגית ברמה 2 אמצעי זהירות.
