Este protocolo permite que os pesquisadores gerem vírus pseudotipos que podem ser usados com segurança para estudar eventos de entrada viral de vírus altamente patogênicos, como o sal coronavírus e a maioria dos coronavírus. Esta técnica versátil baseia-se na fácil transfecção transitória de configuração. Este sistema também pode ser aplicado para produzir partículas pseudotipadas com proteínas de fusão de outros vírus, não apenas coronavírus S.Para melhores resultados é importante monitorar a saúde celular e a densidade para transfecção, bem como para infecção por vírus pseudotipo.
Demonstrando este procedimento serão Tiffany Tang, e Lakshmi Nathan. Estudantes de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, lave cuidadosamente as células HEK293T com 10 mililitros de 37 graus Celsius, DPBS pré-aquecidos duas vezes.
Em seguida, aspire o supernaente e anexar células com um mililitro de solução de 25% de trippsina que foi pré-aquecido a 37 graus Celsius. Do que, incubar o frasco de células a 37 graus Celsius em ambiente de dióxido de carbono de 5% por três a cinco minutos até que as células comecem a se desprender. Adicione quatro mililitros de DMEM completos para desativar a solução de trippsina.
E então contar células usando um slide de contagem de células e um microscópio leve. Células diluídas para 500.000 células por mililitro com DMEM completo. Em seguida, semente dois mililitros por poço da solução celular em uma placa de cultura tecidual de 6 poços.
E mova suavemente a placa para frente e para trás e de um lado para o outro para distribuir as células uniformemente. Depois de garantir que as células sejam distribuídas uniformemente, incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono durante a noite ou 16 a 18 horas. Para pré-formar três cotransfecção plasmóide, primeiro misture volumes calculados de plasmídeos e o meio de cultura celular sérico reduzido em um tubo de micro centrífugas.
Incubar a mistura em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione três microliters por poço do reagente de transfecção à base de lipídio a 47 microliters por poço do meio de cultura celular soro reduzido. Incubar a mistura em temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, em um tubo de micro centrífuga, misture quantidades iguais do reagente de transfecção e as soluções plasmidas por tubo subindo e descendo várias vezes. Incubar a mistura em temperatura ambiente por 20 minutos. Após a incubação da placa celular durante a noite, use um microscópio de luz invertido para examinar as células para sua morfologia e densidade.
Em seguida, aspire o meio gasto de células e adicione suavemente um mililitro por poço do meio de cultura celular soro pré-aquecido reduzido a cada poço. Em seguida, adicione 100 microliters da solução de transfecção a cada bem-queda sábia. E incubar as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por quatro a seis horas.
No final da incubação, adicione um mililitro de DMEM de transfecção livre de antibióticos pré-aquecidos, a 37 graus Celsius a cada poço. E incubar as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 48 horas. Para começar a coleta de partículas pseudotipo use um microscópio de luz invertida para exame das células para sua morfologia e condição geral.
A cor do meio deve ser rosa claro ou ligeiramente laranja. Em seguida, transfira os supernacantes das células transfeinadas para 50 mililitros de tubos cônicos centrífugas. Centrifugar os tubos a 290 vezes a gravidade durante sete minutos para remover detritos celulares.
Em seguida, o filtro esclareceu o supernascer através de um filtro estéril de tamanho de 0,45 mícron poros. Faça alíquotas de pequeno volume da solução de vírus pseudotipo em frascos criotipos. E armazená-los a 80 graus Celsius negativos.
Para realizar infecção por partículas pseudotipados, primeiro exame de células sob microscópio leve para confirmar que há um tapete confluente de células. Em seguida, lave as células três vezes com 0,5 mililitros do DPBS pré-aquecido a 37 graus Celsius. Em seguida, aspirar os supernacantes das células e inocular as células com 200 microliters da solução de partículas pseudotipadas descongeladas.
Incubar as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por uma a duas horas. Após o período de incubação, adicione 300 microliters do DMEMc pré-aquecido a 37 graus Celsius. E incubar as células infectadas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 72 horas.
Finalmente aspirar os supernantes das células infectadas. E preceder o ensaio de repórter luciferase. Para quantificar a infectividade de partículas pseudotipdidas primeiro descongelar o substrato de luciferina, armazenado a menos 80 graus Celsius, em cinco vezes o tampão de ensaio luciferase armazenado a menos 20 graus Celsius à temperatura ambiente.
Em seguida, diluir o tampão de ensaio de luciferase para uma concentração de uma vez com água estéril. Em seguida, adicione 100 microliters do buffer diluído a cada poço. E incubar à temperatura ambiente em um roqueiro por 15 minutos.
Para realizar a medição da atividade da luciferase, um bem de cada vez, adicione primeiro 20 microlitradores de substrato de luciferina a um tubo de micro centrífuga. Em seguida, adicione 10 microliters do lysate ao tubo. Misture o conteúdo mexendo suavemente os tubos.
E colocou o tubo em um dispositivo luminômetro. Feche a tampa e meça o valor de luminescência do tubo. Registo a medição relativa das unidades de luz e preceda a análise de dados.
Ensaios de infectividade de SARS-Spp e MERS-Spp em células hospedeiras suscetíveis, mostraram uma forte infectividade média, em comparação com as partículas de controle positivas esperadas. Controles não infectados e partículas de controle negativos sem glicoproteínas de envelope viral. Também os ensaios de atividade da luciferase mostraram dependência de concentração da infectividade sars-Spp e MERS-Spp.
Um aumento da infectividade sars-Spp ou MERS-Spp em células-alvo mal permissivas, transfectados para expressar receptor ACE2 de SARS-Spp, ou receptor DPP4 do MERS-Spp, confirma que o uso de pseudovirões é semelhante ao dos vírus da OTAN para mediar o apego e a entrada de pseudovirações. Verifique duas vezes os cálculos antes de realizar esta etapa. E certifique-se de que todas as soluções estão bem misturadas durante a etapa.
Um ensaio de manchas ocidentais pode ser realizado em partículas pseudotipadas concentradas para avaliar a incorporação de glicoproteína S nas pseudovirações. Embora as partículas pseudotipas descritas aqui sejam substitutos mais seguros do que os vírus da OTAN, elas ainda requerem precauções de nível dois de biossegurança.
