Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, Pseudotypviren zu erzeugen, die sicher verwendet werden können, um virale Eintrittsereignisse von hoch pathogenen Viren, wie Sal Coronavirus und den meisten Coronaviren, zu untersuchen. Diese vielseitige Technik basiert auf der einfachen Einrichtung transient transfektion. Dieses System kann auch angewendet werden, um Partikel zu produzieren, die pseudotypisiert mit Fusionsproteinen anderer Viren sind, nicht nur Coronavirus S.Für beste Ergebnisse ist es wichtig, die Zellgesundheit und -dichte für die Transfektion sowie für Pseudotyp-Virusinfektionen zu überwachen.
Die Demonstration dieses Verfahrens werden Tiffany Tang und Lakshmi Nathan sein. Absolventen meines Labors. Zunächst sorgfältig HEK293T-Zellen mit 10 Millilitern 37 Grad Celsius waschen, dPBS zweimal vorgewärmt.
Als nächstes aspirieren Sie den Überstand und befestigen Sie Zellen mit einem Milliliter 25%Trypsin-Lösung, die bei 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Dann inkubieren Sie den Kolben der Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung für drei bis fünf Minuten, bis die Zellen beginnen, sich zu lösen. Fügen Sie vier Milliliter komplettes DMEM hinzu, um die Trypsin-Lösung zu deaktivieren.
Und dann zählen Sie Zellen mit einem Zellzählschlitten und einem Lichtmikroskop. Verdünnung der Zellen auf 500.000 Zellen pro Milliliter mit vollständigem DMEM. Als nächstes samen Sie zwei Milliliter pro Brunnen der Zelllösung in einer 6-Well-Gewebekulturplatte.
Und bewegen Sie die Platte sanft hin und her und Seite an Seite, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. Nachdem sichergestellt wurde, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Umgebung über Nacht oder 16 bis 18 Stunden. Um drei Plasmid-Kotransfektionen vorzusoformatieren, mischen Sie zunächst berechnete Mengen von Plasmiden und das reduzierte Serumzellkulturmedium in einem Mikrozentrifugenrohr.
Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Dann fügen Sie drei Mikroliter pro Brunnen des lipidbasierten Transfektionsreageims auf 47 Mikroliter pro Brunnen des reduzierten Serumzellkulturmediums hinzu. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Als nächstes, in einem Mikrozentrifugenrohr, mischen sie die gleichen Mengen des Transfektionsreagenzes und der Plasmidlösungen durch Rohrüberschrift enden sie mehrmals nach oben und unten. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Verwenden Sie nach der nächtlichen Inkubation der Zellplatte ein invertiertes Lichtmikroskop, um Zellen auf ihre Morphologie und Dichte zu untersuchen.
Dann, aspirieren Sie das verbrauchte Medium der Zellen und fügen Sie sanft einen Milliliter pro Brunnen des vorgewärmten reduzierten Serumzellkulturmediums zu jedem Brunnen hinzu. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der Transfektionslösung zu jedem Brunnen tropfen weise. Und die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für vier bis sechs Stunden inkubieren.
Am Ende der Inkubation einen Milliliter vorgewärmter antibiotikafreier Transfektion DMEM bei 37 Grad Celsius zu jedem Brunnen hinzufügen. Und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 48 Stunden. Um die Sammlung von Pseudotyppartikeln zu beginnen, verwenden Sie ein invertiertes Lichtmikroskop, um die Zellen auf ihre Morphologie und ihren Allgemeinzustand zu untersuchen.
Die Farbe des Mediums sollte hellrosa oder leicht orange sein. Dann übertragen Sie die Überräube der transfizierten Zellen auf 50 Milliliter konische Zentrifugenröhren. Zentrifugieren Sie die Rohre mit 290-facher Schwerkraft sieben Minuten lang, um Zellablagerungen zu entfernen.
Als nächstes klärt filterüberstand durch einen sterilen 0,45 Mikron Poren-Größe Filter. Machen Sie kleine Volumen Aliquots von Pseudotyp-Virus-Lösung in Kryo-Fläschchen. Und lagern Sie sie bei negativen 80 Grad Celsius.
Um pseudotypisierte Partikelinfektiondurchzuführen, erste Untersuchungszellen unter Lichtmikroskop, um zu bestätigen, dass es einen konfluenten Teppich von Zellen. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,5 Millilitern des vorgewärmten DPBS bei 37 Grad Celsius. Als nächstes aspirieren Sie die Überräube der Zellen und impfen sie die Zellen mit 200 Mikrolitern der aufgetauten pseudotypisierten Partikellösung.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für ein bis zwei Stunden. Nach der Inkubationszeit 300 Mikroliter des vorgewärmten DMEMc bei 37 Grad Celsius hinzufügen. Und die infizierten Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 72 Stunden inkubieren.
Schließlich die Überstand der infizierten Zellen aspirieren. Und vor luziferase Reporter Assay. Um die Infektiosität von pseudotypisierten Partikeln zu quantifizieren, taut zuerst luziferin Substrat, gespeichert bei minus 80 Grad Celsius, bei fünf Mal Luziferase-Assay-Lyse-Puffer bei minus 20 Grad Celsius auf Raumtemperatur gespeichert.
Dann verdünnen Sie den Luziferase-Assay-Lyse-Puffer auf eine einmalige Konzentration mit sterilem Wasser. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Puffers zu jedem Brunnen hinzu. Und bei Raumtemperatur auf einer Wippe für 15 Minuten inkubieren.
Um die Luziferase-Aktivitätsmessung durchzuführen, fügen Sie zunächst 20 Mikroliter Luziferinsubstrat zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzu. Dann fügen Sie 10 Mikroliter des Lysats in das Rohr. Mischen Sie den Inhalt, indem Sie die Rohre sanft streichen.
Und legte die Röhre in ein Luminometer-Gerät. Schließen Sie den Deckel und messen Sie den Lumineszenzwert des Rohres. Zeichnen Sie die Messung der relativen Lichteinheiten auf und gehen Sie der Datenanalyse voraus.
Infektiositätstests von SARS-Spp und MERS-Spp in anfälligen Wirtszellen zeigten eine starke durchschnittliche Infektiosität im Vergleich zu den erwarteten positiven Kontrollpartikeln. Nicht infizierte Kontrollen und die negativen Kontrollpartikel ohne virale Hüllimpfstoffe. Auch Luziferase-Aktivitäts-Assays zeigten Konzentrationsabhängigkeit von SARS-Spp und MERS-Spp-Infektiosität.
Eine Erhöhung der SARS-Spp- oder MERS-Spp-Infektion in schlecht freizügigen Zielzellen, transfiziert, um den ACE2-Rezeptor von SARS-Spp oder den DPP4-Rezeptor von MERS-Spp auszudrücken, bestätigt, dass die Verwendung von Pseudovirionen durch Rezeptoren der Vonzeptorverwendung von Natoviren zur Vermittlung von Anhaftung und Eintrag von Pseudovirionen ähnelt. Überprüfen Sie die Berechnungen, bevor Sie diesen Schritt ausführen. Und stellen Sie sicher, dass alle Lösungen während des Schritts gut gemischt sind.
Ein Western-Blot-Assay kann an konzentrierten pseudotypisierten Partikeln durchgeführt werden, um die Aufnahme von S-Glykoprotein in die Pseudovirionen zu bewerten. Während die hier beschriebenen pseudotypisierten Partikel sicherere Surrogate als Nato-Viren sind, erfordern sie immer noch zwei Vorsichtsmaßnahmen auf Biosicherheitsstufe.
