يسمح هذا البروتوكول للباحثين بتوليد فيروسات من النوع الزائف التي يمكن استخدامها بأمان لدراسة أحداث الدخول الفيروسية للفيروسات شديدة الإمراض، مثل فيروس كورونا والفيروسات التاجية الأكثر. ويستند هذا الأسلوب تنوعا على الإعداد سهلة transfection عابرة. ويمكن أيضا تطبيق هذا النظام لإنتاج جزيئات pseudotyped مع البروتينات الاندماج من الفيروسات الأخرى، وليس فقط كورونافيروس S.For أفضل النتائج من المهم لرصد صحة الخلايا وكثافة لtransfeation وكذلك لعدوى فيروس الزائفة.
إثبات هذا الإجراء سيكون تيفاني تانغ، ولاكشمي ناثان. طلاب الدراسات العليا من مختبري. للبدء، قم بغسل خلايا HEK293T بعناية مع 10 ملليلترات من 37 درجة مئوية، قبل DPBS ساخنة مرتين.
المقبل, الطامح الخلايا الفائقة وإرفاق مع ملليلتر واحد من 25٪ تريبسين الحل الذي تم تسخينها مسبقا في 37 درجة مئوية. من, احتضان قارورة الخلايا في 37 درجة مئوية في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة ثلاث إلى خمس دقائق حتى تبدأ الخلايا فصل. إضافة أربعة ملليلتر من DMEM كاملة لإلغاء تنشيط حل التربسين.
ثم عد الخلايا باستخدام شريحة عد الخلايا والمجهر الخفيف. تخفيف الخلايا إلى 500،000 خلية لكل ملليلتر مع DMEM كاملة. بعد ذلك، بذور مليلتر اثنين في بئر من محلول الخلية في لوحة ثقافة الأنسجة 6-جيدا.
ونقل بلطف لوحة ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب لتوزيع الخلايا بالتساوي. بعد التأكد من أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ البيئة ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها أو 16 إلى 18 ساعة. لpreform ثلاثة cotransfection البلازميد، المزيج الأول وحدات التخزين المحسوبة من البلازميدات وانخفاض خلية المصل ثقافة المتوسطة في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير.
احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم إضافة ثلاثة ميكرولترات لكل بئر من مُكشف transfection القائم على الدهون إلى 47 ميكرولترات لكل بئر من متوسطة زراعة خلايا المصل المخفضة. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
بعد ذلك ، في أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة ، اخلط كميات متساوية من كاشف transfection وحلول البلازميد بواسطة الأنابيب تتجه صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد حضانة لوحة الخلية بين عشية وضحاها ، استخدم مجهرًا خفيفًا مقلوبًا لفحص الخلايا لنظرها في مورفولوجيا وكثافتها.
ثم, التعرق المتوسط المستهلكة من الخلايا وإضافة بلطف ملليلتر واحد في بئر من قبل حرارة انخفاض خلية المصل ثقافة المتوسطة لكل بئر. المقبل، إضافة 100 ميكرولترات من حل transfection إلى كل قطرة جيدا الحكمة. واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع إلى ست ساعات.
في نهاية الحضانة، إضافة ملليلتر واحد من المضادات الحيوية قبل الدافئة مجانا DMEM، في 37 درجة مئوية إلى كل بئر. واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. لبدء جمع جزيئات الزائفة استخدام المجهر ضوء مقلوب لفحص الخلايا لمورفولوجيا والحالة العامة.
يجب أن يكون لون المتوسطة وردي فاتح أو برتقالي قليلاً. ثم، نقل اعالي الخلايا المُقلَلة إلى أنابيب مخروطية مُخرّبة من أجهزة الطرد المركزي 50 ملليلتر. الطرد المركزي الأنابيب في 290 مرة الجاذبية لمدة سبع دقائق لإزالة حطام الخلية.
بعد ذلك، أوضح مرشح supernatant من خلال مصفح حجم المسام 0.45 ميكرون معقم. جعل aliquots حجم صغير من حل فيروس الزائفة في قارورة cryo. وتخزينها في درجة مئوية 80-
لأداء عدوى الجسيمات الزائفة، خلايا الفحص الأولى تحت المجهر الخفيف للتأكد من وجود سجادة التقاء من الخلايا. ثم، غسل الخلايا ثلاث مرات مع 0.5 ملليلتر من DPBS قبل الدافئة في 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، pirate ابراء الخلايا وتطعيم الخلايا مع 200 ميكرولترات من حل الجسيمات الزائفة المذابة.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد فترة الحضانة، إضافة 300 ميكرولترات من DMEMc قبل الدافئة في 37 درجة مئوية. واحتضان الخلايا المصابة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة.
وأخيرا pirnatate عظمى من الخلايا المصابة. واسبق إلى لوسيفراز مراسل الحسبة. لتحديد كمية العدوى من الجسيمات الزائفة ذوبان الركيزة الأولى لوسيفرين، المخزنة في ناقص 80 درجة مئوية، في خمسة وقت لوسيفيراس التحليل العازلة المخزنة في ناقص 20 درجة مئوية لدرجة حرارة الغرفة.
ثم، وتمييع محلول التحليل لوسيفراسيس إلى تركيز مرة واحدة مع الماء المعقم. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت المخفف لكل بئر. واحتضان في درجة حرارة الغرفة على الروك لمدة 15 دقيقة.
لأداء قياس نشاط لوسيفراز، بئر واحد في وقت واحد، أولا إضافة 20 ميكرولترات من الركيزة لوسيفيرين إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير. ثم، إضافة 10 ميكرولترات من lysate إلى الأنبوب. اخلط المحتويات عن طريق نفض الغبار بلطف على الأنابيب.
ووضع الأنبوب في جهاز مضيئة. أغلق الغطاء و قم بقياس قيمة الإنارة للأنبوب. سجل قياس وحدات الإضاءة النسبية، واسبق تحليل البيانات.
وأظهرت مقايسات العدوى من السارس-Spp ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية-Spp في الخلايا المضيفة المعرضة، وجود معدل قوي للعدوى، مقارنة بجزيئات المكافحة الإيجابية المتوقعة. الضوابط غير المصابة والجسيمات التحكم السلبية تفتقر إلى بروتينات غليكوبروتين المغلف الفيروسية. كما أظهرت مقايسات نشاط لوسيفراز الاعتماد على تركيز السارس-Spp ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية-Spp العدوى.
إن زيادة الإصابة بالمتلازمة الالتهابة الرئوية الحادة الوخيمة (سارس-سب) أو متلازمة الشرق الأوسط التنفسية في الخلايا المستهدفة غير المتساهلة بشكل سيئ، التي يتم تحويلها إلى التعبير عن مستقبلات ACE2 من SARS-SPP، أو مستقبلات DPP4 من MERS-Spp، تؤكد أن استخدام مستقبلات الفيروسات الزائفة يشبه استخدام فيروسات حلف شمال الأطلسي للتوسط في مرفق ودخول الفيروسات الزائفة. الحسابات الاختيار المزدوج قبل تنفيذ هذه الخطوة. وتأكد من أن جميع الحلول مختلطة بشكل جيد خلال الخطوة.
ويمكن إجراء فحص البقعة الغربية على جزيئات النماذج الزائفة المركزة لتقييم دمج S الجليكوبروتين في شبكات زائفة. في حين أن الجسيمات الزائفة الموصوفة هنا هي بدائل أكثر أماناً من فيروسات حلف شمال الأطلسي، إلا أنها لا تزال تتطلب مستوى اثنين من الاحتياطات المتعلقة بالسلامة البيولوجية.
