Según los recientes criterios de diagnóstico internacional para los trastornos del espectro de la neuromielitis óptica, anti-AQP4 IgG se considera un biomarcador de diagnóstico central. La detección de IgG anti-AQP4 mediante un ensayo basado en células puede facilitar el diagnóstico clínico. Por lo tanto, el ensayo basado en células es más sensible y específico que otros métodos de detección.
Y se puede aplicar tanto al diagnóstico clínico como a los estudios científicos. En primer lugar, lleve las muestras de suero del paciente, el portaobjetos de biochip, el polvo PBS y el TWEEN 20 del kit de ensayo basado en células refrigeradas a la temperatura ambiente. A continuación, prepare más de 200 mililitros de tampón de lavado PBS que contengan 0,2 por ciento de TWEEN 20 para cada diapositiva de biochip.
Utilice el tampón de lavado para hacer diluciones en serie de 10 veces de cada muestra de suero. Preparar controles positivos y negativos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Agregue 30 microlitros de diluciones seriales de 10 veces de la muestra, el control positivo y el control negativo, a cinco campos de reacción individuales en la bandeja de reactivos.
Sujete el portaobjetos de biochip por sus diapositivas y retire su cubierta protectora sin tocar sus campos de reacción. Coloque el portaobjetos en la parte superior de la bandeja de reactivos e incubar la configuración a temperatura ambiente durante 30 minutos. Enjuague suavemente el portaobjetos biochip con el tampón de lavado.
A continuación, sumerja en un vaso de precipitados de 500 mililitros lleno de 100 mililitros del tampón de lavado, y déjelo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Saque el portaobjetos biochip del tampón de lavado. Use una toalla de papel para limpiar cuidadosamente cualquier tampón restante del exterior de los campos de reacción.
Deje que el portaobjetos se seque al aire durante uno o dos minutos. En la sala oscura, añada 25 microlitros de anticuerpos secundarios fluorescentes a cada campo de reacción de la bandeja de reactivos. Coloque el portaobjetos en la parte superior de la bandeja de reactivos e incubar la configuración a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Enjuague suavemente el portaobjetos biochip con el tampón de lavado. A continuación, sumérgelo en un vaso de precipitados de 500 mililitros lleno de 100 mililitros del tampón de lavado fresco, y déjalo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Saque el portaobjetos biochip del tampón de lavado.
Use una toalla de papel para limpiar cuidadosamente cualquier tampón restante del exterior de los campos de reacción. Deje que el portaobjetos se seque al aire durante uno o dos minutos. Agregue cuidadosamente una gota del medio de incrustación a cada campo de reacción en la diapositiva del biochip.
Por último, selle el portaobjetos biochip con un vidrio de cubierta evitando burbujas de aire y proceda con imágenes. La débil intensidad de fluorescencia del control negativo observado en la zona infectada indica la unión inespecífica del anticuerpo secundario. La comparación entre las intensidades de fluorescencia detectadas del control positivo en las áreas infectadas y no infectadas indica la unión específica del IgG anti-AQP4 a AQP4M1 en las células infectadas.
El suero negativo anti-AQP4 IgG muestra patrones de unión similares al control negativo en áreas infectadas y no infectadas. El suero positivo muestra patrones de unión similares al control positivo en áreas infectadas y no infectadas. Las muestras se consideran anti-AQP4 IgG positivas cuando la fluorescencia aumenta heterogéneamente en el área infectada.
La intensidad de la fluorescencia está correlacionada con el título de IgG anti-AQP4 en el suero. Las muestras se consideran probablemente positivas cuando sólo un pequeño número de células en el área trans infectada muestran intensidades de fluorescencia detectables. Una muestra debe considerarse como anti-AQP4 IgG negativo cuando su intensidad en la zona infectada es sólo homogéneamente más fuerte que en la zona no infectada.
Evitar las burbujas de aire es vital y difícil. Para eliminar las burbujas de aire, utilice primero una pipeta para evitar burbujas de aire en las gotas. En segundo lugar, mientras aplica la diapositiva de biochip a la bandeja de reactivos, primero deje que un lado de la diapositiva toque las gotas, y luego nivele la diapositiva lentamente.
Además, no toque los campos de reacción a lo largo del experimento.
