Secondo i recenti criteri diagnostici internazionali per i disturbi dello spettro della neuromielite ottica, l'IgG anti-AQP4 è considerato un biomarcatore diagnostico di base. Il rilevamento IgG anti-AQP4 tramite saggio a base cellulare può facilitare la diagnosi clinica. Quindi, il saggio basato sulle cellule è più sensibile e specifico rispetto ad altri metodi di rilevamento.
E può essere applicato sia alla diagnosi clinica che agli studi scientifici. In primo luogo, portare i campioni di siero del paziente, lo scivolo biochip, la polvere PBS e l'TWEEN 20 dal kit di dosaggio a base di cellule refrigerate alla temperatura ambiente. Quindi, preparare più di 200 millilitri di tampone di lavaggio PBS contenente lo 0,2% di TWEEN 20 per ogni scivolo biochip.
Utilizzare il tampone di lavaggio per effettuare diluizioni seriali di 10 volte di ogni campione di siero. Preparare controlli positivi e negativi secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 30 microlitri di diluizioni seriali 10 volte del campione, il controllo positivo e il controllo negativo a cinque singoli campi di reazione sul vassoio del reagente.
Tenere lo scivolo biochip per i suoi scivoli e rimuovere la sua copertura protettiva senza toccarne i campi di reazione. Mettere lo scivolo sopra il vassoio del reagente e incubare la configurazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Risciacquare delicatamente lo scivolo biochip con il tampone di lavaggio.
Quindi immergerlo in un becher da 500 millilitri riempito con 100 millilitri del tampone di lavaggio e lasciarlo a temperatura ambiente per 10 minuti. Eserti lo scivolo biochip dal tampone di lavaggio. Utilizzare un tovagliolo di carta per pulire con cura il buffer rimanente dall'esterno dei campi di reazione.
Lasciare asciugare l'aria dello scivolo per uno o due minuti. Nella stanza buia, aggiungere 25 microlitri di anticorpo secondario fluorescente a ciascun campo di reazione del vassoio del reagente. Mettere lo scivolo sopra il vassoio del reagente e incubare la configurazione a temperatura ambiente per 30 minuti.
Risciacquare delicatamente lo scivolo biochip con il tampone di lavaggio. Quindi immergerlo in un becher da 500 millilitri riempito con 100 millilitri del tampone di lavaggio fresco e lasciarlo a temperatura ambiente per 10 minuti. Eserti lo scivolo biochip dal tampone di lavaggio.
Utilizzare un tovagliolo di carta per pulire con cura il buffer rimanente dall'esterno dei campi di reazione. Lasciare asciugare l'aria dello scivolo per uno o due minuti. Aggiungere con cura una goccia del mezzo di incorporamento a ciascun campo di reazione sullo scivolo biochip.
Infine, sigillare lo scivolo biochip con un vetro di copertura evitando bolle d'aria e procedere con l'imaging. La debole intensità di fluorescenza del controllo negativo osservato nell'area infetta indica il legame aspecifico dell'anticorpo secondario. Il confronto tra le intensità di fluorescenza rilevate del controllo positivo nelle aree infette e non infette indica il legame specifico dell'IgG anti-AQP4 ad AQP4M1 nelle cellule infette.
Il siero negativo IgG anti-AQP4 mostra modelli di legame simili al controllo negativo sia nelle aree infette che in aree non infette. Il siero positivo mostra modelli di legame simili al controllo positivo sia nelle aree infette che in aree non infette. I campioni sono considerati anti-AQP4 IgG positivi quando la fluorescenza aumenta eterogeneamente nell'area infetta.
L'intensità della fluorescenza è correlata al titer IgG anti-AQP4 nel siero. I campioni sono considerati probabilmente positivi quando solo un piccolo numero di cellule nell'area trasfettata mostra intensità di fluorescenza rilevabili. Un campione deve essere considerato anti-AQP4 IgG negativo quando la sua intensità nell'area infetta è solo omogeneamente più forte che nell'area non infetta.
Evitare bolle d'aria è vitale e difficile. Per eliminare le bolle d'aria, utilizzare prima una pipetta per evitare bolle d'aria nelle goccioline. In secondo luogo, durante l'applicazione della diapositiva biochip al vassoio del reagente, lasciare prima che un lato della diapositiva tocchi le goccioline, quindi livellare lentamente la diapositiva.
Inoltre, non toccare i campi di reazione durante l'esperimento.
