Nöromiyelit optik spektrum bozuklukları için son uluslararası tanı kriterlerine göre, anti-AQP4 IgG bir çekirdek tanı biyomarker olarak kabul edilir. Hücre bazlı test ile anti-AQP4 IgG tespiti klinik tanıyı kolaylaştırabilir. Yani, hücre tabanlı test daha hassas ve diğer algılama yöntemleri daha spesifiktir.
Hem klinik tanıya hem de bilimsel çalışmalara uygulanabilir. İlk olarak, hastanın serum örneklerini, biyoçip slaytını, PBS tozunu ve tween 20'yi soğutulmuş hücre bazlı tahkikat kitini oda sıcaklığına getirin. Daha sonra, her biyoçip slayt için yüzde 0,2 TWEEN 20 içeren 200 mililitreden fazla PBS yıkama tamponu hazırlayın.
Her serum örneğinin 10 kat seri seyreltmeyapmak için yıkama tamponu kullanın. Üreticinin talimatlarına göre olumlu ve negatif kontroller hazırlayın. Reaktif tepsisindeki beş ayrı reaksiyon alanına numunenin 10 kat seri seyreltmelerinin 30 mikrolitresini, pozitif kontrolü ve negatif kontrolü ekleyin.
Biyoçip slaytını slaytlarının yanında tutun ve reaksiyon alanlarına dokunmadan koruyucu kapağını çıkarın. Slaydın reaktif tepsisinin üstüne koyun ve 30 dakika oda sıcaklığında kurulum kuluçkaya yatırın. Biochip slaytı yıkama tamponuyla hafifçe durulayın.
Daha sonra yıkama tampon100 mililitre dolu bir 500 mililitre kabına batırın ve 10 dakika oda sıcaklığında bırakın. Yıkama tamponundan biyoçip kaydıraği çıkar. Reaksiyon alanlarının dışından kalan tamponları dikkatlice silmek için kağıt havlu kullanın.
Slaytı 1-2 dakika kurutun. Karanlık odada, reaktif tepsisinin her reaksiyon alanına 25 mikrolitre floresan ikincil antikor ekleyin. Slaydın reaktif tepsisinin üstüne koyun ve 30 dakika oda sıcaklığında kurulum kuluçkaya yatırın.
Biochip slaytı yıkama tamponuyla hafifçe durulayın. Daha sonra 100 mililitre taze yıkama tamponu yla dolu 500 mililitrelik bir kabın içine daldırın ve 10 dakika oda sıcaklığında bırakın. Yıkama tamponundan biyoçip kaydıraği çıkar.
Reaksiyon alanlarının dışından kalan tamponları dikkatlice silmek için kağıt havlu kullanın. Slaytı 1-2 dakika kurutun. Biyoçip slaytındaki her reaksiyon alanına katıştırma ortamının bir damlasını dikkatlice ekleyin.
Son olarak, hava kabarcıkları kaçınarak bir kapak camı ile biyoçip slayt mühür ve görüntüleme ile devam edin. Enfekte bölgede gözlenen negatif kontrolün zayıf floresan yoğunluğu ikincil antikor spesifik olmayan bağlanma gösterir. Enfekte ve enfekte olmayan bölgelerde pozitif kontrolün saptanan floresan yoğunlukları arasındaki karşılaştırma, enfekte hücrelerde anti-AQP4 IgG'nin AQP4M1'e özel bağlanmasını gösterir.
Anti-AQP4 IgG negatif serum hem enfekte hem de enfekte olmayan bölgelerde negatif kontrol benzer bağlama desenleri gösterir. Pozitif serum hem enfekte hem de enfekte olmayan bölgelerde ki pozitif kontrole benzer bağlanma desenleri gösterir. Enfekte bölgede floresan heterojen olarak arttığında örnekler anti-AQP4 IgG pozitif olarak kabul edilir.
Floresan yoğunluğu serumda anti-AQP4 IgG titretile ilişkilidir. Transfektasyon alanındaki hücrelerin sadece az sayıda tespit edilebilir floresan yoğunlukları gösterdiğinde örnekler muhtemelen pozitif olarak kabul edilir. Enfekte bölgedeki yoğunluğu enfekte olmayan alana göre sadece homojen olarak daha güçlü olduğunda bir örnek anti-AQP4 IgG negatif olarak kabul edilmelidir.
Hava kabarcıkları kaçınmak hayati ve zordur. Hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için, ilk damlacıkları hava kabarcıkları önlemek için bir pipet kullanın. İkinci olarak, biyoçip slaytını reaktif tepsisine uygularken, önce slaydın bir tarafının damlacıklara dokunmasına izin verin ve ardından slaydın yavaşça düzedeyim.
Ayrıca, deney boyunca tepki alanlarına dokunmayın.
