Selon les critères diagnostiques internationaux récents pour des désordres de spectre d’optica de neuromyélite, l’IgG d’anti-AQP4 est considéré comme biomarqueur diagnostique de noyau. La détection d’IgG anti-AQP4 par essai cellulaire peut faciliter le diagnostic clinique. Ainsi, l’analyse cellulaire est plus sensible et spécifique que d’autres méthodes de détection.
Et il peut être appliqué à la fois au diagnostic clinique et aux études scientifiques. Tout d’abord, apportez les échantillons de sérum du patient, la glissière de biopuce, la poudre de PBS, et le TWEEN 20 du kit frigorifique d’analyse à base de cellules à la température ambiante. Ensuite, préparez plus de 200 millilitres de tampon de lavage PBS contenant 0,2 pour cent de TWEEN 20 pour chaque diapositive de biopuce.
Utilisez le tampon de lavage pour effectuer 10 dilutions périodiques de chaque échantillon de sérum. Préparez des contrôles positifs et négatifs selon les instructions du fabricant. Ajouter 30 microlitres de dilutions en série 10 fois de l’échantillon, le contrôle positif et le contrôle négatif à cinq champs de réaction individuels sur le plateau de réaccage.
Tenez la glissière de biopuce par ses glissières et retirez son couvercle protecteur sans toucher ses champs de réaction. Placez la lame sur le plateau du reagent et incuber la configuration à température ambiante pendant 30 minutes. Rincez doucement la diapositive de biopuce avec le tampon de lavage.
Plongez-le ensuite dans un bécher de 500 millilitres rempli de 100 millilitres du tampon de lavage, et laissez-le à la température ambiante pendant 10 minutes. Sortez la diapositive de biopuce du tampon de lavage. Utilisez une serviette en papier pour essuyer soigneusement tout tampon restant de l’extérieur des champs de réaction.
Laisser sécher à l’air libre pendant une à deux minutes. Dans la pièce sombre, ajouter 25 microlitres d’anticorps secondaires fluorescents à chaque champ de réaction du plateau de reagent. Placez la lame sur le plateau du reagent et incuber la configuration à température ambiante pendant 30 minutes.
Rincez doucement la diapositive de biopuce avec le tampon de lavage. Plongez-le ensuite dans un bécher de 500 millilitres rempli de 100 millilitres du tampon de lavage frais, et laissez-le à la température ambiante pendant 10 minutes. Sortez la diapositive de biopuce du tampon de lavage.
Utilisez une serviette en papier pour essuyer soigneusement tout tampon restant de l’extérieur des champs de réaction. Laisser sécher à l’air libre pendant une à deux minutes. Ajouter délicatement une goutte du milieu d’intégration à chaque champ de réaction sur la diapositive de la biopuce.
Enfin, sceller la diapositive de biopuce avec un verre de couverture tout en évitant les bulles d’air et procéder à l’imagerie. La faible intensité de fluorescence du contrôle négatif observé dans la zone infectée indique la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire. La comparaison entre les intensités de fluorescence détectées du contrôle positif dans les zones infectées et non infectées indique la liaison spécifique de l’IgG anti-AQP4 à L’AQP4M1 dans les cellules infectées.
Le sérum négatif anti-AQP4 IgG montre des modèles contraignants similaires au contrôle négatif dans les zones infectées et non infectées. Le sérum positif montre des modèles contraignants similaires au contrôle positif dans les zones infectées et non infectées. Les échantillons sont considérés comme anti-AQP4 IgG positif lorsque la fluorescence augmente hétérogènement dans la zone infectée.
L’intensité de la fluorescence est corrélée au titer anti-AQP4 IgG dans le sérum. Les échantillons sont considérés comme probablement positifs lorsque seul un petit nombre de cellules dans la zone transfectée présentent des intensités de fluorescence détectables. Un échantillon doit être considéré comme anti-AQP4 IgG négatif lorsque son intensité dans la zone infectée n’est que homogènement plus forte que dans la zone non infectée.
Il est essentiel et difficile d’éviter les bulles d’air. Pour éliminer les bulles d’air, utilisez d’abord une pipette pour éviter les bulles d’air dans les gouttelettes. Deuxièmement, lors de l’application de la diapositive biopuce sur le plateau de réaccente, laissez d’abord un côté de la diapositive toucher les gouttelettes, puis niveler la diapositive lentement.
En outre, ne touchez pas les champs de réaction tout au long de l’expérience.
