В соответствии с недавними международными диагностическими критериями для нейромиелита optica расстройства спектра, анти-A'P4 IgG считается основным диагностическим биомаркером. Обнаружение анти-A'P4 IgG с помощью клеточного анализа может облегчить клиническую диагностику. Таким образом, анализ на основе клеток является более чувствительным и конкретным, чем другие методы обнаружения.
И он может быть применен как к клинической диагностике, так и к научным исследованиям. Во-первых, довнесите образцы сыворотки пациента, слайд биочипа, порошок PBS и TWEEN 20 из комплекта анализа на основе холодильных клеток до комнатной температуры. Затем подготовьте более 200 миллилитров буфера для мытья PBS, содержащего 0,2 процента TWEEN 20 для каждого слайда биочипа.
Используйте буфер для мытья, чтобы сделать 10-кратное серийное разбавление каждого образца сыворотки. Подготовка положительного и отрицательного контроля в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте 30 микролитров 10-кратного последовательного разбавления образца, положительный контроль и отрицательный контроль к пяти индивидуальным полям реакции на реагентном подносе.
Держите биочип слайд на слайдах и удалить защитную крышку, не касаясь его реакционной поля. Положите слайд на верхней части реагента лоток и инкубировать установки при комнатной температуре в течение 30 минут. Аккуратно промойте биочип слайд с буфером мытья.
Затем погрузите его в стакан 500 миллилитров, наполненный 100 миллилитров буфера для мытья, и оставьте его при комнатной температуре на 10 минут. Вынуть биочип слайд из буфера мытья. Используйте бумажное полотенце, чтобы тщательно стереть любой оставшийся буфер из-за пределов поля реакции.
Пусть слайд воздух сухой в течение одной-двух минут. В темной комнате добавьте 25 микролитров флуоресцентных вторичных антител к каждому реакционной полю реагентного лотка. Положите слайд на верхней части реагента лоток и инкубировать установки при комнатной температуре в течение 30 минут.
Аккуратно промойте биочип слайд с буфером мытья. Затем погрузите его в 500 миллилитров стакан заполнены 100 миллилитров свежего буфера мытья, и оставить его при комнатной температуре в течение 10 минут. Вынуть биочип слайд из буфера мытья.
Используйте бумажное полотенце, чтобы тщательно стереть любой оставшийся буфер из-за пределов поля реакции. Пусть слайд воздух сухой в течение одной-двух минут. Аккуратно добавьте одну каплю среды встраивания к каждому поле реакции на слайде биочипа.
Наконец, печать биочип слайд с крышкой стекла, избегая пузырьков воздуха и приступить к визуализации. Слабая интенсивность флуоресценции отрицательного контроля, наблюдаемая в зараженной области, указывает на неспецифическую привязку вторичного антитела. Сравнение обнаруженных интенсивностей флуоресценции положительного контроля в инфицированных и неинфицированных районах указывает на специфическую привязку анти-АЗП4 ИгГ к АКП4М1 в инфицированных клетках.
Отрицательная сыворотка против АЗП4 IgG показывает связывающие модели, аналогичные негативному контролю как в инфицированных, так и в неинфицированных областях. Положительная сыворотка показывает связывающие модели, аналогичные положительному контролю как в инфицированных, так и в неинфицированных областях. Образцы считаются анти-A'P4 IgG положительным, когда флуоресценция неоднородно увеличивается в зараженной области.
Интенсивность флуоресценции коррелирует с анти-A'P4 IgG titer в сыворотке крови. Образцы считаются, вероятно, положительными, когда лишь небольшое количество клеток в трансфицированной области показывают обнаруживаемые интенсивности флуоресценции. Образец следует рассматривать как отрицательный анти-A'P4 IgG, когда его интенсивность в зараженном районе только однородно сильнее, чем в неинфицированной области.
Как избежать пузырьков воздуха является жизненно важным и трудным. Чтобы устранить пузырьки воздуха, сначала используйте пипетки, чтобы избежать пузырьков воздуха в каплях. Во-вторых, при применении биочип слайд реагент лоток, сначала пусть одна сторона слайда коснуться капель, а затем выровнять слайд медленно.
Кроме того, не прикасайтесь к полям реакции на протяжении всего эксперимента.
