De acordo com os recentes critérios de diagnóstico internacional para distúrbios do espectro neuromielite optica, o IgG anti-AQP4 é considerado um biomarcador de diagnóstico central. A detecção de IgG anti-AQP4 por ensaio baseado em células pode facilitar o diagnóstico clínico. Assim, o ensaio baseado em células é mais sensível e específico do que outros métodos de detecção.
E pode ser aplicado tanto ao diagnóstico clínico quanto aos estudos científicos. Primeiro, leve as amostras de soro do paciente, o slide biochip, o pó PBS e o TWEEN 20 do kit de ensaio à base de células refrigeradas à temperatura ambiente. Em seguida, prepare mais de 200 mililitros de tampão de lavagem PBS contendo 0,2% de TWEEN 20 para cada slide de biochip.
Use o tampão de lavagem para fazer diluições seriais de 10 vezes de cada amostra de soro. Prepare controles positivos e negativos de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 30 microliters de diluições seriais de 10 vezes da amostra, o controle positivo e o controle negativo, a cinco campos de reação individuais na bandeja de reagentes.
Segure o slide biochip por seus slides e remova sua tampa protetora sem tocar em seus campos de reação. Coloque o slide em cima da bandeja de reagente e incubar a configuração em temperatura ambiente por 30 minutos. Enxágue suavemente o slide de biochip com o tampão de lavagem.
Em seguida, mergulhe-o em um béquer de 500 mililitros cheio de 100 mililitros do tampão de lavagem, e deixe-o na temperatura ambiente por 10 minutos. Retire o slide biochip do tampão de lavagem. Use uma toalha de papel para limpar cuidadosamente qualquer tampão restante fora dos campos de reação.
Deixe o deslizamento secar por um a dois minutos. Na sala escura, adicione 25 microliters de anticorpo secundário fluorescente a cada campo de reação da bandeja de reagente. Coloque o slide em cima da bandeja de reagente e incubar a configuração em temperatura ambiente por 30 minutos.
Enxágue suavemente o slide de biochip com o tampão de lavagem. Em seguida, mergulhe-o em um béquer de 500 mililitros cheio de 100 mililitros do tampão de lavagem fresco, e deixe-o na temperatura ambiente por 10 minutos. Retire o slide biochip do tampão de lavagem.
Use uma toalha de papel para limpar cuidadosamente qualquer tampão restante fora dos campos de reação. Deixe o deslizamento secar por um a dois minutos. Adicione cuidadosamente uma gota do meio de incorporação a cada campo de reação no slide biochip.
Por fim, sele o slide biochip com um vidro de cobertura, evitando bolhas de ar e proceda com imagens. A intensidade fraca de fluorescência do controle negativo observado na área infectada indica a ligação inespecífica do anticorpo secundário. A comparação entre as intensidades detectadas de fluorescência do controle positivo nas áreas infectadas e não infectadas indica a ligação específica do IgG anti-AQP4 ao AQP4M1 nas células infectadas.
O soro negativo IgG anti-AQP4 mostra padrões de ligação semelhantes ao controle negativo em áreas infectadas e não infectadas. O soro positivo mostra padrões de ligação semelhantes ao controle positivo em áreas infectadas e não infectadas. As amostras são consideradas anti-AQP4 IgG positivas quando a fluorescência aumenta heterogeneamente na área infectada.
A intensidade da fluorescência está correlacionada com o título anti-AQP4 IgG no soro. As amostras são consideradas provavelmente positivas quando apenas um pequeno número de células na área transfeinada mostram intensidades detectáveis de fluorescência. Uma amostra deve ser considerada como anti-AQP4 IgG negativa quando sua intensidade na área infectada é apenas homogêneamente mais forte do que na área não infectada.
Evitar bolhas de ar é vital e difícil. Para eliminar bolhas de ar, primeiro use uma pipeta para evitar bolhas de ar em gotículas. Em segundo lugar, ao aplicar o slide biochip na bandeja do reagente, primeiro deixe um lado do slide tocar as gotículas e, em seguida, nivele o slide lentamente.
Além disso, não toque nos campos de reação durante todo o experimento.
