Nach den jüngsten internationalen diagnostischen Kriterien für Neuromyelitis optica Spektrum Störungen, Anti-AQP4 IgG gilt als kerndiagnostische Biomarker. Die Anti-AQP4 IgG-Erkennung durch zellbasierten Assay kann die klinische Diagnose erleichtern. Daher ist der zellbasierte Assay empfindlicher und spezifischer als andere Nachweismethoden.
Und es kann sowohl auf klinische Diagnose als auch auf die wissenschaftlichen Studien angewendet werden. Bringen Sie zunächst die Serumproben des Patienten, den Biochipschlitten, das PBS-Pulver und das TWEEN 20 aus dem auf Kühlzellen basierenden Assay-Kit auf die Raumtemperatur. Dann bereiten Sie mehr als 200 Milliliter PBS-Waschpuffer mit 0,2 Prozent TWEEN 20 für jeden Biochip-Dia vor.
Verwenden Sie den Waschpuffer, um 10-fache serielle Verdünnungen jeder Serumprobe zu machen. Bereiten Sie positive und negative Kontrollen gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Fügen Sie 30 Mikroliter der 10-fachen seriellen Verdünnungen der Probe, der Positivkontrolle und der Negativkontrolle zu fünf einzelnen Reaktionsfeldern auf der Reagenzschale hinzu.
Halten Sie den Biochip-Dia an seinen Dias und entfernen Sie seine Schutzhülle, ohne seine Reaktionsfelder zu berühren. Setzen Sie die Folie auf das Reagenzfach und inkubieren Sie das Setup bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Spülen Sie den Biochip-Schlitten vorsichtig mit dem Waschpuffer ab.
Dann tauchen Sie es in einen 500 Milliliter Becher gefüllt mit 100 Milliliter des Waschpuffers, und lassen Sie es bei der Raumtemperatur für 10 Minuten. Nehmen Sie die Biochip-Rutsche aus dem Waschpuffer. Verwenden Sie ein Papiertuch, um den verbleibenden Puffer von außerhalb der Reaktionsfelder vorsichtig wegzuwischen.
Lassen Sie das Dia ein bis zwei Minuten lufttrocknen. Fügen Sie im dunklen Raum 25 Mikroliter fluoreszierenden Sekundärantikörper in jedes Reaktionsfeld der Reagenzschale ein. Setzen Sie die Folie auf das Reagenzfach und inkubieren Sie das Setup bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Spülen Sie den Biochip-Schlitten vorsichtig mit dem Waschpuffer ab. Dann tauchen Sie es in einen 500 Milliliter Becher gefüllt mit 100 Milliliter des frischen Waschpuffers, und lassen Sie es bei der Raumtemperatur für 10 Minuten. Nehmen Sie die Biochip-Rutsche aus dem Waschpuffer.
Verwenden Sie ein Papiertuch, um den verbleibenden Puffer von außerhalb der Reaktionsfelder vorsichtig wegzuwischen. Lassen Sie das Dia ein bis zwei Minuten lufttrocknen. Fügen Sie vorsichtig einen Tropfen des Einbettungsmediums zu jedem Reaktionsfeld auf dem Biochip-Dia hinzu.
Schließlich versiegeln Sie den Biochip-Schlitten mit einem Deckglas, während Luftblasen vermieden werden, und fahren Sie mit der Bildgebung fort. Die schwache Fluoreszenzintensität der im infizierten Bereich beobachteten Negativkontrolle deutet auf die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers hin. Der Vergleich zwischen den nachgewiesenen Fluoreszenzintensitäten der Positivkontrolle in den infizierten und nicht infizierten Gebieten zeigt die spezifische Bindung des Anti-AQP4 IgG an AQP4M1 in den infizierten Zellen.
Das Anti-AQP4 IgG Negativserum zeigt Bindungsmuster ähnlich der Negativkontrolle in infizierten und nicht infizierten Bereichen. Das positive Serum zeigt Bindungsmuster, die der positiven Kontrolle sowohl in infizierten als auch in nicht infizierten Gebieten ähneln. Proben gelten als anti-AQP4 IgG positiv, wenn die Fluoreszenz im infizierten Bereich heterogen zunimmt.
Die Intensität der Fluoreszenz korreliert mit Anti-AQP4 IgG Titer im Serum. Proben werden wahrscheinlich als positiv angesehen, wenn nur eine kleine Anzahl von Zellen im transfäfierten Bereich nachweisbare Fluoreszenzintensitäten aufweisen. Eine Probe sollte als Anti-AQP4 IgG negativ betrachtet werden, wenn ihre Intensität im infizierten Bereich nur homogen stärker ist als im nicht infizierten Bereich.
Die Vermeidung von Luftblasen ist von entscheidender Bedeutung und schwierig. Um Luftblasen zu beseitigen, verwenden Sie zuerst eine Pipette, um Luftblasen in Tröpfchen zu vermeiden. Zweitens, während der Biochip-Rutsche auf das Reagenz-Fach auftragen, lassen Sie zuerst eine Seite des Dias die Tröpfchen berühren, und dann die Folie langsam nivellieren.
Berühren Sie außerdem nicht die Reaktionsfelder während des gesamten Experiments.
