La fabricación de nanopartículas recubiertas de lípidos con el método de inyección rápida proporciona un sistema estable de administración de fármacos para la terapia oncológica. Esta técnica es una técnica simple, rápida, escalable y reproducible para la fabricación de nanopartículas que encapsula fármacos hidrofóbicos. Esta técnica es aplicable para la fabricación de nanopartículas diagnósticas y terapéuticas a partir de materiales hidrfobos que se pueden utilizar eficazmente en varias condiciones de la enfermedad.
Esta técnica de fabricación, junto con DLS, se puede utilizar para estudiar la nucleación y el crecimiento de materiales hidrófobos, como lípidos, proteínas y polímeros. Conocer las propiedades químicas físicas de la sustancia de la droga es fundamental antes de fabricar las nanopartículas. Además, asegúrese de utilizar las concentraciones correctas de lípidos de recubrimiento.
La demostración visual de este método es fundamental para mostrar la simplicidad de la técnica de fabricación y para mostrar la entrega exitosa del fármaco como nanopartículas a las células. Se deben tomar precauciones cuando se trabaja con cloroformo y formaldehído, y se requiere trabajar bajo una campana de humo. Para empezar, dispensar 2,4 mililitros de 250 micromolares falcarindiol solución disuelta en 70%etanol en un vial de centelleo.
Usando un concentrador de muestras, evapore la fracción líquida durante aproximadamente cuatro horas para obtener falcarindiol seco. Con el concentrador de muestras, entregue gas sobre la muestra a temperatura ambiente para concentrar la muestra. Una vez secado, añadir los componentes que se muestran aquí al vial de centelleo en una campana de humo, asegurándose de limpiar la jeringa con cloroformo después de añadir cada componente para evitar la contaminación cruzada.
A continuación, cierre inmediatamente los viales que contienen los lípidos para que el disolvente no se evapore y modifique así la concentración. Envuelva el vial con papel de aluminio para proteger a DiI de la luz y deje la muestra durante la noche en el desecador para evaporar el cloroformo. Al día siguiente, disolver la muestra desecada en etanol absoluto para hacer un volumen final de 1,2 mililitros.
Esta solución representa la fase orgánica. Tome un vial de vidrio de 12 mililitros y llénelo con nueve mililitros de agua purificada. A continuación, agregue una pulga magnética en el vial que contenga nueve mililitros de agua.
Coloque el vial sobre un agitador magnético y revuelva a 500 rpm. A continuación, conecte una jeringa de vidrio de un mililitro al sistema dispensador y tire lentamente del cloroformo dentro y fuera de la jeringa de vidrio al menos 10 veces. Dispensar el cloroformo en su colector de residuos cada vez.
Limpiar la jeringa con cloroformo ayuda a evitar cualquier contaminación. Ahora prepara la jeringa con etanol. Priming reemplaza el disolvente viejo, así como elimina cualquier burbuja de aire.
Con la jeringa, aspirar un mililitro de la fase orgánica e insertar la jeringa en el vial de vidrio hasta la mitad de la marca de agua de nueve mililitros. Manténgalo estable en el centro del vial e inyecte la solución a 833 microlitros por segundo pulsando el botón de dispensación del sistema de dosificación. Esto genera 10 microlitros de 50 nanopartículas micromolares recubiertas de lípidos de falcarindiol en 10%etanol.
Esta velocidad de inyección se ha encontrado para lograr las nanopartículas más finas con una distribución de tamaño de partícula estrecha. Durante la inyección, es importante asegurarse de que la aguja está insertada en el centro, estable y recta. Inmediatamente después de la inyección, retire el vial del agitador y transfiera la muestra a un matraz inferior redondo de 50 mililitros.
Ataque el matraz al evaporador rotatorio y evapore un mililitro del disolvente orgánico a temperatura ambiente. Tenga cuidado para evitar la formación excesiva de burbujas. Transfiera la suspensión de nanopartículas del matraz a otro vial de vidrio de 12 mililitros.
Asegúrese de que el volumen es de nueve mililitros y, a continuación, divida la muestra en dos viales de vidrio de 12 mililitros. A continuación, añada 0,5 mililitros de agua ultra pura en uno de los viales y 0,5 mililitros de solución salina tamponada de fosfato 10X en el otro vial. Encienda el instrumento de dispersión de luz digital y ajuste la temperatura deseada a 20 grados Celsius hasta que se estabilice.
A continuación, establezca los parámetros del instrumento como se muestra aquí. Llene la cubeta de plástico con un mililitro de suspensión de nanopartículas e inicie la medición. Informe del tamaño medido en función del disolvente utilizado.
Semilla de aproximadamente 50.000 células en hojas de cubierta estériles de 1,5 colocadas en placa de seis pozos para obtener una densidad celular de aproximadamente 30%Luego agregue medio de cultivo con el fin de tener un volumen final de tres mililitros en cada pozo. Incubar las células durante 24 horas en condiciones de cultivo estándar. Al día siguiente, añadir tres microlitros de la solución de nanopartículas para una concentración final de falcarindiol de cinco micromolares.
Luego devuelva las células a la incubadora durante 24 horas. Después de 24 horas de tratamiento, lave las células dos veces con PBS y luego fijelas en 4%formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la fijación, permeabilizar las células con 0.1%Tritón X-100 durante 30 minutos.
A continuación, lávelos dos veces con PBS y tiñerlos con 250 microlitros de 300 DAPI nanomolares durante cinco minutos, protegidos de la luz. Coloque el resbalón de la cubierta en una diapositiva usando una gota de PBS. Gire a una subjetiva de 150x y transfiera la diapositiva al escenario de un microscopio de fluorescencia de campo ancho equipado con una cámara CCD multiplicada por electrones.
Celdas de imagen utilizando el canal GFP-LP. Además, verifique la absorción de las nanopartículas en las células tomando imágenes de microscopía confocal utilizando un objetivo de aceite 63x con una apertura numérica de 1.4. Imagen DiI usando un láser de argón a 514 nanómetros y DAPI usando un láser de dos fotón a 780 nanómetros.
Las nanopartículas no recubiertas de falcarindiol formadas en agua y medidas en PBS mostraron una alta polidispersidad, con un índice de DP de 0,571. Este valor indica una distribución amplia y no uniforme de los tamaños de partícula. Por el contrario, las nanopartículas lípidas recubiertas de falcarindiol fabricadas en este video eran de 74,1 nanómetros con un índice de polidispersidad de 0,182, indicaron una distribución relativamente monodispersa y uniforme de tamaños de partículas.
Como primera observación de las nanopartículas dentro de las células, se adquirieron imágenes de microscopía de epifluorescencia después de 24 horas de tratamiento. Las nanopartículas se visualizaban como puntos blancos y brillantes, y se podía hipotetizar que las nanopartículas se encontraban dentro de las células que rodean el núcleo. Para verificar que las nanopartículas de falcarindiol habían entrado en las células, también se realizó una microscopía confocal en las células.
Un gran número de nanopartículas se muestran aquí, esparcidas en el citoplasma en cada célula. Estos resultados muestran que las nanopartículas actúan como un sistema estable de administración de fármacos para el falcarindiol. Al intentar este procedimiento, es importante inyectar la solución a la velocidad de inyección correcta, manteniendo la siembra estable, en el centro, para asegurar una mezcla adecuada.
Este procedimiento se puede utilizar para cualquier fármaco hidrófobo para formular nanopartículas terapéuticas o para agentes de imagen para formular nanopartículas de diagnóstico que se pueden utilizar en diversas condiciones de la enfermedad, como el cáncer. Esta técnica permitió realizar más investigaciones sobre el mecanismo por el cual las nanopartículas son tomadas por las células, así como sus imágenes de células vivas y en el estudio del efecto anticancerígeno del fármaco.
