A fabricação de nanopartículas revestidas de lipídios com o método de injeção rápida fornece um sistema estável de entrega de medicamentos para terapia do câncer. Esta técnica é uma técnica simples, rápida, escalável e reprodutível para fabricação de nanopartículas que encapsula drogas hidrofóbicas. Esta técnica é aplicável para a fabricação de nanopartículas diagnósticas e terapêuticas a partir de materiais hidrofóbicos que podem ser efetivamente utilizados em várias condições da doença.
Esta técnica de fabricação, juntamente com dLS, pode ser usada para estudar a nucleação e o crescimento de materiais hidrofóbicos, como lipídios, proteínas e polímeros. Conhecer as propriedades químicas físicas da sua substância é fundamental antes de fabricar as nanopartículas. Além disso, certifique-se de usar as concentrações corretas de lipídios de revestimento.
A demonstração visual deste método é fundamental para mostrar a simplicidade da técnica de fabricação e mostrar o sucesso da entrega da droga como nanopartículas para as células. É preciso precaução ao trabalhar com clorofórmio e formaldeído, e trabalhar sob um capô de fumaça é necessário. Para começar, dispense 2,4 mililitros de 250 micromolars de solução de estoque falcarindiol dissolvido em 70% de etanol em um frasco de cintilação.
Usando um concentrador de amostra, evaporar a fração líquida por aproximadamente quatro horas para obter falcarindiol seco. Usando o concentrador de amostras, entregue gás sobre a amostra à temperatura ambiente para concentrar a amostra. Uma vez seco, adicione os componentes aqui mostrados ao frasco de cintilação em uma capa de fumaça, certificando-se de limpar a seringa com clorofórmio depois de adicionar cada componente para evitar contaminação cruzada.
Em seguida, feche imediatamente os frascos contendo os lipídios para que o solvente não evapore e assim modifique a concentração. Enrole o frasco com papel alumínio para proteger a DiI da luz e deixe a amostra durante a noite no desiccator para evaporar o clorofórmio. No dia seguinte, dissolva a amostra dessecada em etanol absoluto para fazer um volume final de 1,2 mililitros.
Essa solução representa a fase orgânica. Pegue um frasco de vidro de 12 mililitros e encha-o com nove mililitros de água purificada. Em seguida, adicione uma pulga magnética no frasco contendo nove mililitros de água.
Coloque o frasco em um agitador magnético e mexa a 500 rpm. Em seguida, conecte uma seringa de vidro de um mililitro ao sistema de distribuição e puxe lentamente clorofórmio para dentro e para fora da seringa de vidro pelo menos 10 vezes. Distribua o clorofórmio em seu coletor de lixo cada vez.
Limpar a seringa com clorofórmio ajuda a evitar qualquer contaminação. Agora forque a seringa com etanol. O escoramento substitui o solvente antigo, bem como remove quaisquer bolhas de ar.
Usando a seringa, aspire um mililitro da fase orgânica e insira a seringa no frasco de vidro até o meio da marca de água de nove mililitros. Mantenha-o estável no meio do frasco e injete a solução a 833 microliters por segundo pressionando o botão de distribuição no sistema de distribuição. Isso gera 10 microlitadores de 50 nanopartículas lipídicas micromolar revestidas de falcarindiol em 10% de etanol.
Esta velocidade de injeção foi encontrada para alcançar as melhores nanopartículas com distribuição estreita do tamanho das partículas. Durante a injeção, é importante ter certeza de que a agulha está inserida no centro, estável e reta. Imediatamente após a injeção, remova o frasco do agitador e transfira a amostra para um frasco fundo redondo de 50 mililitros.
Ataque o frasco ao evaporador rotativo, e evapore um mililitro do solvente orgânico à temperatura ambiente. Tenha cuidado para evitar o excesso de formação de bolhas. Transfira a suspensão da nanopartícula do frasco para outro frasco de vidro de 12 mililitros.
Certifique-se de que o volume é de nove mililitros e, em seguida, divida a amostra em dois frascos de vidro de 12 mililitros. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de água ultra pura em um dos frascos e 0,5 mililitro de salina tamponada de fosfato de 10X no outro frasco. Ligue o instrumento de dispersão da luz digital e coloque a temperatura desejada em 20 graus Celsius até estabilizar.
Em seguida, defina os parâmetros do instrumento como mostrado aqui. Encha a cuvette de plástico com um mililitro de suspensão de nanopartículas e inicie a medição. Informe o tamanho medido dependendo do solvente utilizado.
Sementes aproximadamente 50.000 células em deslizamentos de cobertura estéreis 1.5 colocados em placa de seis poços para obter uma densidade celular de aproximadamente 30%, em seguida, adicionar meio cultura a fim de ter um volume final de três mililitros em cada poço. Incubar as células por 24 horas sob condições de cultura padrão. No dia seguinte, adicione três microlitadores da solução de nanopartículas para uma concentração falcarindiol final de cinco micromolar.
Em seguida, devolva as células à incubadora por 24 horas. Após 24 horas de tratamento, lave as células duas vezes com PBS e, em seguida, fixe-as em 4% de formaldeído por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a fixação, permeabilize as células com 0,1%Triton X-100 por 30 minutos.
Em seguida, lave-os duas vezes com PBS, e manche-os com 250 microliters de 300 DAPI nanomolar por cinco minutos, protegidos da luz. Coloque o deslizamento da tampa em um slide usando uma gota de PBS. Vire para uma subjetiva de 150x, e transfira o slide para o estágio de um microscópio de fluorescência de campo largo equipado com uma câmera CCD multiplicada por elétrons.
Células de imagem usando o canal GFP-LP. Além disso, verifique a absorção das nanopartículas nas células, tomando imagens de microscopia confocal usando um objetivo de óleo de 63x com uma abertura numérica de 1,4. Imagem DiI usando um laser de argônio a 514 nanômetros e DAPI usando um laser de dois fótons a 780 nanômetros.
As nanopartículas não revestidas de falcarindiol formadas em água e medidas na PBS apresentaram alta polidispersidade, com índice de DP de 0,571. Este valor indica distribuição ampla e não uniforme de tamanhos de partículas. Em contraste, as nanopartículas revestidas lipídicas de falcarindiol fabricadas neste vídeo foram de 74,1 nanômetros com um índice de polidispersidade de 0,182, indicando uma distribuição relativamente monodisperse e uniforme de tamanhos de partículas.
Como primeira observação das nanopartículas dentro das células, imagens de microscopia de epifluorescência foram adquiridas após 24 horas de tratamento. As nanopartículas foram visualizadas como pontos brancos e brilhantes, e pode-se supor que as nanopartículas estavam localizadas dentro das células ao redor do núcleo. Para verificar se as nanopartículas falcarindiais haviam entrado nas células, a microscopia confocal também foi realizada nas células.
Um grande número de nanopartículas são mostradas aqui, espalhadas no citoplasma em cada célula. Estes resultados mostram que as nanopartículas agem como um sistema estável de entrega de medicamentos para falcarindiol. Ao tentar este procedimento, é importante injetar a solução na velocidade de injeção certa, mantendo a semeadura estável, no centro, para garantir a mistura adequada.
Este procedimento pode ser usado para qualquer droga hidrofóbica para formular nanopartículas terapêuticas ou para agentes de imagem para formular nanopartículas diagnósticas que podem ser usadas em várias condições da doença, como o câncer. Esta técnica permitiu que mais pesquisas fossem conduzidas sobre o mecanismo pelo qual as nanopartículas são tomadas pelas células, bem como sua imagem celular viva e no estudo do efeito anticancerígeno da droga.
