신속한 주입 방법을 이용한 지질 코팅 나노입자의 제조는 암 치료를 위한 안정적인 약물 전달 시스템을 제공한다. 이 기술은 소수성 약물을 캡슐화하는 나노 입자 제조를위한 간단하고 빠르며 확장 가능하며 재현 가능한 기술입니다. 이 기술은 여러 질병 조건에서 효과적으로 사용될 수 있는 소화포빅 물질로부터 진단 및 치료 나노 입자를 제조하는 데 적용됩니다.
이 제조 기술은 DLS와 함께 지질, 단백질 및 폴리머와 같은 소수성 물질의 핵 형성 및 성장을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 약물 물질의 물리적 화학적 특성을 아는 것은 나노 입자를 제작하기 전에 중요합니다. 또한 코팅 지질의 정확한 농도를 사용해야 합니다.
이 방법의 시각적 데모는 제조 기술의 단순을 보여주고 세포에 나노 입자로 약물의 성공적인 전달을 표시하는 것이 중요합니다. 예방 조치는 클로로폼과 포름알데히드로 작업 할 때 취해야하며 연기 후드 아래에서 작업해야합니다. 시작하려면 250 마이크로몰라 팔카린디올 스톡 용액의 2.4 밀리리터를 신자극 바이알에 70% 에탄올로 용해시한다.
시료 농축기를 사용하여, 건조 팔카린디올을 얻기 위해 약 4 시간 동안 액체 분획을 증발. 시료 농축기를 사용하여 실온에서 시료에 가스를 전달하여 시료를 농축합니다. 일단 건조되면, 연기 후드에 반짝임 유리병에 여기에 표시된 구성 요소를 추가, 교차 오염을 방지하기 위해 각 구성 요소를 추가 한 후 클로로 폼으로 주사기를 청소해야합니다.
그런 다음 즉시 용매가 증발하지 않도록 지질을 포함하는 바이알을 닫고 농도를 수정합니다. 유리병을 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 DiI를 보호하고 시료를 건조기에서 하룻밤 동안 방치하여 클로로폼을 증발시보냅니다. 다음 날, 1.2 밀리리터의 최종 부피를 만들기 위해 절대 에탄올에 건조 된 샘플을 용해.
이 솔루션은 유기 상을 나타냅니다. 12 밀리리터 유리 바이알을 가지고 정제 된 물의 9 밀리리터로 채웁니다. 그런 다음 9 밀리리터의 물을 포함하는 유리병에 자기 벼룩을 넣습니다.
유리병을 자기 교반기 위에 놓고 500rpm에 저어줍니다. 다음으로 1밀리리터 유리 주사기를 디스펜싱 시스템에 부착하고 유리 주사기 안팎에서 클로로폼을 10회 이상 천천히 당깁니다. 클로로폼을 매번 폐수량에 분배합니다.
클로로폼으로 주사기를 청소하면 오염을 방지할 수 있습니다. 이제 에탄올로 주사기를 프라임. 프라이밍은 기존 용매를 대체할 뿐만 아니라 기포를 제거합니다.
주사기를 사용하여 유기 상1밀리리터를 흡인하고, 주사기를 유리 바이알에 삽입하여 9밀리리터 워터 마크의 중간까지 삽입합니다. 바이알 의 중간에 안정적으로 유지하고 디스펜싱 시스템의 디스펜스 버튼을 눌러 초당 833 마이크로 리터에서 용액을 주입하십시오. 이것은 10%에 탄올에 있는 falcarindiol의 50 개의 마이크로몰라 지질 코팅 나노 입자의 10 마이크로 리터를 생성합니다.
이 사출 속도는 좁은 입자 크기 분포와 최고의 나노 입자를 달성하기 위해 발견되었습니다. 주입 하는 동안, 바늘중앙에 삽입 되어 있는지 확인 하는 것이 중요 하다, 안정적이 고 직선. 주입 직후, 교반기에서 유리병을 제거하고 샘플을 50 밀리리터 둥근 바닥 플라스크로 옮킵니다.
플라스크를 회전 증발기로 공격하고 실온에서 유기 용매의 1 밀리리터를 증발시다. 과도한 거품 형성을 피하기 위해 주의하십시오. 플라스크에서 다른 12 밀리리터 유리 바이알로 나노 입자 현탁액을 전달합니다.
부피가 9밀리리터인지 확인하고 샘플을 12밀리리터 유리 바이알 2개로 분할합니다. 그런 다음 바이알 중 하나에 초순수 수분 0.5 밀리리터를 추가하고 다른 유리병에 10X 인산염 완충식식염의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 디지털 라이트 산란 기기를 켜고 안정될 때까지 원하는 온도를 섭씨 20도로 설정합니다.
그런 다음 여기에 표시된 대로 계측기 매개 변수를 설정합니다. 플라스틱 큐벳을 나노입자 서스펜션 1밀리리터로 채우고 측정을 시작합니다. 사용된 용매에 따라 측정된 크기를 보고합니다.
약 50, 000세포를 멸균1.5개의 커버 슬립을 6웰 플레이트에 배치하여 약 30%의 세포 밀도를 얻은 다음 각 웰에 3개의 밀리리터의 최종 부피를 갖기 위해 배양 배지를 첨가한다. 표준 배양 조건하에서 24시간 동안 세포를 배양한다. 다음 날, 5 마이크로 몰러의 최종 팔카린디올 농도에 대한 나노 입자 용액의 3 마이크로 리터를 추가합니다.
그런 다음 세포를 인큐베이터로 24시간 동안 되돌려 보입니다. 24 시간 의 치료 후, PBS로 두 번 세포를 세척한 다음 실온에서 10 분 동안 4 %의 포름알데히드로 고정하십시오. 고정 후, 30 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100으로 세포를 과미화하십시오.
그런 다음 PBS로 두 번 씻고 빛으로부터 보호되는 300 나노 몰러 DAPI의 250 마이크로 리터로 얼룩지게합니다. PBS 한 방울을 사용하여 커버 슬립을 슬라이드에 놓습니다. 150x 주관적인 것으로 전환하고, 전자곱된 CCD 카메라를 장착한 광야 형광 현미경의 단계로 슬라이드를 전달한다.
GFP-LP 채널을 사용하는 이미지 셀입니다. 또한, 1.4의 수치 조리개와 함께 63배 오일 목표를 사용하여 공초점 현미경 이미지를 사용하여 나노입자의 세포 내 섭취를 검증한다. 780 나노미터에서 2광자 레이저를 사용하여 514 나노미터 및 DAPI에서 아르곤 레이저를 사용하는 이미지 DiI.
물에서 형성되고 PBS에서 측정된 팔카린디올의 코팅되지 않은 나노입자는 PD 지수 0.571로 높은 다각형성을 보였다. 이 값은 파티클 크기의 광범위하고 균일하지 않은 분포를 나타냅니다. 대조적으로, 이 비디오에서 제조된 팔카린디올의 지질 코팅 나노입자는 0.182의 다분산지수를 가진 74.1나노미터였으며, 입자 크기의 비교적 단분산 및 균일한 분포를 나타냈다.
세포 내부의 나노 입자의 첫 번째 관찰로, 상피 현미경 이미지는 치료 24 시간 후에 획득되었다. 나노 입자는 흰색, 밝은 점으로 시각화되었으며, 나노 입자가 핵을 둘러싼 세포 내부에 위치했다는 가설이 될 수 있습니다. 팔카린디올 나노 입자가 세포에 들어갔다는 것을 확인하기 위해, 공초점 현미경 검사법은 또한 세포에 수행되었다.
많은 수의 나노 입자가 여기에 표시되어 모든 세포에서 세포질에 흩어져 있습니다. 이러한 결과는 나노 입자가 팔카린디올에 대한 안정적인 약물 전달 시스템으로 작용한다는 것을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안, 적절한 혼합을 보장하기 위해, 중앙에, 안정적으로 시드를 유지, 오른쪽 주입 속도로 솔루션을 주입하는 것이 중요합니다.
이 절차는 치료 나노 입자를 공식화하거나 암과 같은 다양한 질병 조건에서 사용될 수있는 진단 나노 입자를 공식화하기 위해 모든 소수성 약물에 사용할 수 있습니다. 이 기술은 나노 입자가 세포에 의해 채택되는 메커니즘에 더 많은 연구를 가능하게, 뿐만 아니라 그것의 살아있는 세포 화상 진찰 및 약의 항암 효과 공부에.
