ייצור חלקיקים מצופים שומנים עם שיטת הזרקה מהירה מספק מערכת אספקת תרופות יציבה לטיפול בסרטן. טכניקה זו היא טכניקה פשוטה, מהירה, מדרגית ותכלית לייצור חלקיקים המאכלסת תרופות הידרופוביות. טכניקה זו ישימה לייצור חלקיקים אבחוניים וטיפוליים מחומרים הידראפוביים שניתן להשתמש בהם ביעילות במספר מחלות.
טכניקת ייצור זו, יחד עם DLS, יכולה לשמש לחקר הגרעין והצמיחה של חומרים הידרופוביים, כגון שומנים, חלבונים ופולימרים. לדעת את המאפיינים הכימיים הפיזיים של חומר התרופה שלך הוא קריטי לפני המצאת חלקיקים. כמו כן, הקפד להשתמש בריכוזים הנכונים של שומנים ציפוי.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדי להראות את הפשטות של טכניקת ייצור כדי להראות את המסירה המוצלחת של התרופה כמו חלקיקים לתאים. יש לנקוט אמצעי זהירות בעת עבודה עם כלורופורם ופורמלדהיד, נדרשת עבודה מתחת למכסה המנוע של האדים. כדי להתחיל, לוותר על 2.4 מיליליטר של 250 תמיסת מניית פלקרינדיול מיקרומולרי מומס ב 70% אתנול בבקבוקון scintillation.
באמצעות ריכוז מדגם, להתאדות את שבר הנוזל במשך כארבע שעות כדי להשיג falcarindiol יבש. באמצעות רכז המדגם, לספק גז על המדגם בטמפרטורת החדר כדי לרכז את המדגם. לאחר התייבשות, מוסיפים את הרכיבים המוצגים כאן בקבוקון scintillation במכסה המנוע אדים, הקפד לנקות את המזרק עם כלורופורם לאחר הוספת כל רכיב כדי למנוע זיהום צולב.
לאחר מכן סגור מיד את הבקבוקונים המכילים את השומנים, כך הממס אינו מתאדה ובכך לשנות את הריכוז. לעטוף את הבקבוקון עם רדיד אלומיניום כדי להגן על DiI מפני אור ולהשאיר את המדגם לילה ב desiccator כדי לאדות את הכלורופורם. למחרת, להמיס את המדגם מיובש באתנול מוחלט לעשות נפח סופי של 1.2 מיליליטר.
פתרון זה מייצג את השלב האורגני. קח בקבוקון זכוכית 12 מיליליטר ולמלא אותו עם תשעה מיליליטר של מים מטוהרים. לאחר מכן מוסיפים פרעוש מגנטי לתוך הבקבוקון המכיל תשעה מיליליטר של מים.
מניחים את הבקבוקון על ערבוב מגנטי ומערבבים ב-500 סל"ד. לאחר מכן חבר מזרק זכוכית מיליליטר אחד למערכת ההתחלקות ומשך באיטיות כלורופורם פנימה ומבחוץ של מזרק הזכוכית לפחות 10 פעמים. מחלקים את הכלורופורם לאספן הפסולת שלו בכל פעם.
ניקוי המזרק עם כלורופורם עוזר למנוע כל זיהום. עכשיו ראש המזרק עם אתנול. Priming מחליף את הממס הישן, כמו גם מסיר את כל בועות האוויר.
באמצעות המזרק, שאף מיליליטר אחד של השלב האורגני, והכנס את המזרק לתוך בקבוקון הזכוכית עד לאמצע סימן המים תשעה מיליליטר. לשמור אותו יציב באמצע הבקבוקון, ולהזריק את הפתרון ב 833 microliters לשנייה על ידי לחיצה על כפתור לוותר על מערכת חלוקת. זה מייצר 10 microliters של 50 חלקיקים מצופים שומנים מיקרומולר של פלקרינדיול ב 10%אתנול.
מהירות הזרקה זו נמצאה כדי להשיג חלקיקים הטובים ביותר עם התפלגות גודל חלקיקים צרים. בעת הזרקת, חשוב לוודא כי המחט מוכנס במרכז, יציב וישר. מיד לאחר ההזרקה, להסיר את הבקבוקון מן stirrer ולהעביר את המדגם לבקבוקון תחתון עגול 50 מיליליטר.
לתקוף את הבקבוק לאידוי סיבובי, ולאדות מיליליטר אחד של הממס האורגני בטמפרטורת החדר. להיות זהיר כדי למנוע היווצרות בועה עודף. מעבירים את ההשעיה הננו-חלקיקית מהבקבוקון לבקבוקון זכוכית נוסף של 12 מיליליטר.
ודא שהנפח הוא תשעה מיליליטר, ולאחר מכן לפצל את המדגם בשני בקבוקוני זכוכית 12 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף 0.5 מיליליטר של מים טהורים במיוחד באחד הבקבוקונים ו 0.5 מיליליטר של 10X פוספט אגף מלוחים בבקבוקון השני. הפעל את מכשיר פיזור האור הדיגיטלי, והגדר את הטמפרטורה הרצויה ל-20 מעלות צלזיוס עד שהיא תתייצב.
לאחר מכן הגדר את פרמטרי הכלי כפי שמוצג כאן. מלאו את ה-cuvette מפלסטיק במיליליטר אחד של מתלי ננו-חלקיקים, והתחלו במדידה. דווח על הגודל הנמדד בהתאם ממס ששימש.
זרעים כ 50, 000 תאים על 1.5 תלושי כיסוי סטריליים להציב צלחת שש בארות כדי לקבל צפיפות תאים של כ 30%ואז להוסיף מדיום תרבות על מנת לקבל נפח סופי של שלושה מיליליטר בכל באר. דגירה התאים במשך 24 שעות בתנאי תרבות סטנדרטיים. למחרת, להוסיף שלושה microliters של פתרון חלקיקים לריכוז falcarindiol הסופי של חמישה micromolar.
ואז להחזיר את התאים לאנקובטור במשך 24 שעות. לאחר 24 שעות של טיפול, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן לתקן אותם 4% פורמלדהיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר קיבעון, חלחל לתאים עם 0.1%Triton X-100 למשך 30 דקות.
לאחר מכן לשטוף אותם פעמיים עם PBS, ולהכתים אותם עם 250 microliters של 300 DAPI ננומולר במשך חמש דקות, מוגן מפני אור. מקם את החלקת המכסה על שקופית באמצעות טיפה של PBS. הפוך לסובייקטיבי 150x, והעבר את השקופית לשלב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב המצויד במצלמת CCD מוכפלת אלקטרונים.
תאי תמונה המשתמשים בערוץ GFP-LP. בנוסף, לאמת את ספיגת חלקיקים לתוך התאים על ידי לקיחת תמונות מיקרוסקופיה confocal באמצעות יעד שמן 63x עם צמצם מספרי של 1.4. תמונה DiI באמצעות לייזר ארגון ב 514 ננומטר ו DAPI באמצעות לייזר שני פוטון ב 780 ננומטר.
חלקיקים לא צותתים של פלקרינדיול שנוצרו במים ונמדדו ב- PBS הראו פולידיספרסיות גבוהה, עם מדד PD של 0.571. ערך זה מציין התפלגות רחבה ולא אחידה של גדלי חלקיקים. לעומת זאת, חלקיקים מצופים שומנים של פלקרינדיול מפוברק בסרטון זה היו של 74.1 ננומטר עם מדד polydispersity של 0.182, הצביע על מונודיספרסה יחסית חלוקה אחידה של גדלי חלקיקים.
כתצפית ראשונה של חלקיקים בתוך התאים, תמונות מיקרוסקופיה epifluorescence נרכשו לאחר 24 שעות של טיפול. הננו-חלקיקים הודמיו כנקודות לבנות ובהירות, ונו-חלקיקים היו ממוקמים בתוך התאים המקיפים את הגרעין. כדי לוודא כי חלקיקי פלקרינדיול נכנסו לתאים, מיקרוסקופיה קונפוקל בוצעה על התאים גם כן.
מספר גדול של חלקיקים מוצגים כאן, מפוזרים בציטופלסמה בכל תא. תוצאות אלה מראות כי חלקיקים לפעול כמערכת אספקת תרופות יציבה עבור falcarindiol. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להזריק את הפתרון במהירות ההזרקה הנכונה, שמירה על הזריעה יציבה, במרכז, כדי להבטיח ערבוב נכון.
הליך זה יכול לשמש עבור כל תרופה הידרופובית כדי לנסח חלקיקים טיפוליים או עבור סוכני הדמיה כדי לגבש חלקיקים אבחון שניתן להשתמש בהם בתנאי מחלה שונים, כגון סרטן. טכניקה זו אפשרה מחקר נוסף להתבצע על המנגנון שבאמצעותו חלקיקים להילקח על ידי תאים, כמו גם הדמיה תאים חיים שלה על חקר ההשפעה נגד סרטן של התרופה.
