La fabbricazione di nanoparticelle rivestite di lipidi con il metodo di iniezione rapida fornisce un sistema stabile di somministrazione di farmaci per la terapia del cancro. Questa tecnica è una tecnica semplice, veloce, scalabile e riproducibile per la fabbricazione di nanoparticelle che incapsula farmaci idrofobi. Questa tecnica è applicabile per fabbricare nanoparticelle diagnostiche e terapeutiche da materiali idrfobici che possono essere efficacemente utilizzati in diverse condizioni di malattia.
Questa tecnica di fabbricazione, insieme al DLS, può essere utilizzata per studiare la nucleazione e la crescita di materiali idrofobi, come lipidi, proteine e polimeri. Conoscere le proprietà chimiche fisiche della sostanza del farmaco è fondamentale prima di fabbricare le nanoparticelle. Inoltre, assicurati di utilizzare le corrette concentrazioni di lipidi di rivestimento.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per mostrare la semplicità della tecnica di fabbricazione e mostrare il successo della consegna del farmaco come nanoparticelle alle cellule. È necessario prendere precauzioni quando si lavora con cloroformio e formaldeide ed è necessario lavorare sotto una cappa aspirante. Per iniziare, erogare 2,4 millilitri di soluzione di 250 soluzione di falcarindiolo micromolare sciolti in 70% di etanolo in una fiala a scintillazione.
Utilizzando un concentratore di campioni, evaporare la frazione liquida per circa quattro ore per ottenere falcarindiolo secco. Utilizzando il concentratore del campione, consegnare gas sul campione a temperatura ambiente per concentrare il campione. Una volta asciugato, aggiungere i componenti qui mostrati alla fiala a scintillazione in una cappa aspirante, assicurandosi di pulire la siringa con cloroformio dopo aver aggiunto ogni componente per evitare la contaminazione incrociata.
Quindi chiudere immediatamente le fiale contenenti i lipidi in modo che il solvente non evapori e quindi modificare la concentrazione. Avvolgere la fiala con un foglio di alluminio per proteggere DiI dalla luce e lasciare il campione durante la notte nell'essiccatore per evaporare il cloroformio. Il giorno dopo, sciogliere il campione essiccato in etanolo assoluto per fare un volume finale di 1,2 millilitri.
Questa soluzione rappresenta la fase organica. Prendere una fiala di vetro da 12 millilitri e riempirla con nove millilitri di acqua purificata. Quindi aggiungere una pulce magnetica nel flaconcino contenente nove millilitri di acqua.
Posizionare il flaconcino su un agitatore magnetico e mescolare a 500 giri/min. Successivamente attaccare una siringa di vetro millilitro al sistema di erogazione e estrarre lentamente il cloroformio in uscita dalla siringa di vetro almeno 10 volte. Erogare il cloroformio nel collettore di rifiuti ogni volta.
Pulire la siringa con cloroformio aiuta ad evitare qualsiasi contaminazione. Ora innesca la siringa con l'etanolo. L'adescamento sostituisce il vecchio solvente e rimuove eventuali bolle d'aria.
Utilizzando la siringa, aspirare un millilitro della fase organica e inserire la siringa nel flaconcino di vetro fino al centro del segno dell'acqua di nove millilitri. Mantenerlo fermo al centro del flaconcino e iniettare la soluzione a 833 microlitri al secondo premendo il pulsante di erogazione sul sistema di erogazione. Questo genera 10 microlitri di 50 nanoparticelle micromolare rivestite di lipidi di falcarindiolo nel 10% di etanolo.
Questa velocità di iniezione è stata trovata per ottenere le migliori nanoparticelle con una distribuzione stretta delle dimensioni delle particelle. Durante l'iniezione, è importante assicurarsi che l'ago sia inserito al centro, stabile e dritto. Immediatamente dopo l'iniezione, rimuovere il flaconcino dall'agitatore e trasferire il campione in un pallone inferiore rotondo da 50 millilitri.
Attaccare il pallone all'evaporatore rotante ed evaporare un millilitro del solvente organico a temperatura ambiente. Sii cauto per evitare l'eccesso di formazione di bolle. Trasferire la sospensione della nanoparticella dal pallone ad un'altra fiala di vetro da 12 millilitri.
Assicurarsi che il volume sia di nove millilitri, quindi dividere il campione in due flaconcini di vetro da 12 millilitri. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di acqua ultra pura in uno dei flaconcini e 0,5 millilitri di 10X soluzione salina tamponata dal fosfato nell'altra fiala. Accendere lo strumento di dispersione della luce digitale e impostare la temperatura desiderata su 20 gradi Celsius fino a quando non si stabilizza.
Quindi impostare i parametri dello strumento come mostrato qui. Riempire la cuvetta di plastica con un millilitro di sospensione della nanoparticella e iniziare la misurazione. Segnalare la dimensione misurata a seconda del solvente utilizzato.
Seme circa 50.000 cellule su sterili 1,5 scivolamenti di copertura posizionati in piastra a sei pozza per ottenere una densità cellulare di circa il 30%Quindi aggiungere il mezzo di coltura per avere un volume finale di tre millilitri in ogni pozzo. Incubare le cellule per 24 ore in condizioni di coltura standard. Il giorno dopo, aggiungere tre microlitri della soluzione di nanoparticelle per una concentrazione finale di falcarindiolo di cinque micromolari.
Quindi riportare le cellule nell'incubatrice per 24 ore. Dopo 24 ore di trattamento, lavare le cellule due volte con PBS, quindi fissarle in formaldeide al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, permeabilizzare le celle con 0,1%Tritone X-100 per 30 minuti.
Quindi lavarli due volte con PBS e macchiarli con 250 microlitri di DAPI nanomolare per cinque minuti, protetti dalla luce. Posizionare il coperchio su una diapositiva utilizzando una goccia di PBS. Passare a un soggettivo 150x e trasferire lo scivolo allo stadio di un microscopio a fluorescenza a campo largo dotato di una telecamera CCD moltiplicata per elettroni.
Celle immagine che utilizzano il canale GFP-LP. Inoltre, verificare l'assorbimento delle nanoparticelle nelle cellule prendendo immagini di microscopia confocale usando un obiettivo di olio 63x con un'apertura numerica di 1,4. Image DiI usando un laser argon a 514 nanometri e DAPI usando un laser a due fotoni a 780 nanometri.
Le nanoparticelle non rivestite di falcarindiolo formate in acqua e misurate in PBS mostravano un'elevata polidispersità, con indice PD di 0,571. Questo valore indica una distribuzione ampia e non uniforme delle dimensioni delle particelle. Al contrario, le nanoparticelle rivestite di lipidi di falcarindiolo fabbricate in questo video erano di 74,1 nanometri con un indice di polidispersità di 0,182, indicavano una distribuzione relativamente monodispersa e uniforme delle dimensioni delle particelle.
Come prima osservazione delle nanoparticelle all'interno delle cellule, le immagini della microscopia a epifluorescenza sono state acquisite dopo 24 ore di trattamento. Le nanoparticelle sono state visualizzate come punti bianchi e luminosi, e si potrebbe ipotizzare che le nanoparticelle si trovavano all'interno delle cellule che circondano il nucleo. Per verificare che le nanoparticelle di falcarindiolo fossero entrate nelle cellule, è stata eseguita anche la microscopia confocale sulle cellule.
Un gran numero di nanoparticelle sono mostrate qui, sparse nel citoplasma in ogni cellula. Questi risultati mostrano che le nanoparticelle fungono da sistema stabile di somministrazione di farmaci per il falcarindiolo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante iniettare la soluzione alla giusta velocità di iniezione, mantenendo la semina costante, al centro, per garantire una corretta miscelazione.
Questa procedura può essere utilizzata per qualsiasi farmaco idrofobico per formulare nanoparticelle terapeutiche o per agenti di imaging per formulare nanoparticelle diagnostiche che possono essere utilizzate in varie condizioni di malattia, come il cancro. Questa tecnica ha permesso di condurre ulteriori ricerche sul meccanismo con cui le nanoparticelle vengono prese dalle cellule, così come la sua imaging cellulare viva e sullo studio dell'effetto anticancro del farmaco.
