Die Herstellung von lipidbeschichteten Nanopartikeln mit der Schnellinjektionsmethode sorgt für ein stabiles Arzneimittelabgabesystem für die Krebstherapie. Diese Technik ist eine einfache, schnelle, skalierbare und reproduzierbare Technik für die Nanopartikelherstellung, die hydrophobe Medikamente kapselt. Diese Technik eignet sich zur Herstellung diagnostischer und therapeutischer Nanopartikel aus hydrphoben Materialien, die bei mehreren Krankheitserkrankungen effektiv eingesetzt werden können.
Diese Herstellungstechnik kann zusammen mit DLS verwendet werden, um die Keimbildung und das Wachstum hydrophober Materialien wie Lipide, Proteine und Polymere zu untersuchen. Die Physikalisch-chemischen Eigenschaften Ihrer Wirkstoffsubstanz zu kennen, ist vor der Herstellung der Nanopartikel von entscheidender Bedeutung. Achten Sie auch darauf, die richtigen Konzentrationen von Beschichtungslipiden zu verwenden.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Einfachheit der Herstellungstechnik zu zeigen und die erfolgreiche Abgabe des Arzneimittels als Nanopartikel an die Zellen zu zeigen. Bei der Arbeit mit Chloroform und Formaldehyd ist Vorsicht geboten, und die Arbeit unter einer Dunstabzugshaube ist erforderlich. Zunächst 2,4 Milliliter 250 Mikromolar Falcarindiol-Stammlösung in 70%Ethanol in einer Szintillationsdurchstechflasche gelöst geben.
Mit einem Probenkonzentrator die Flüssigkeitsfraktion etwa vier Stunden lang verdampfen, um trockenes Falcarindiol zu erhalten. Mit dem Probenkonzentrator Gas bei Raumtemperatur über die Probe liefern, um die Probe zu konzentrieren. Nach dem Trocknen fügen Sie die hier gezeigten Komponenten in einer Dunstabzugshaube in die Szintillationsflasche ein, um die Spritze nach zugabe jeder Komponente mit Chloroform zu reinigen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
Schließen Sie dann sofort die Durchstechflaschen, die die Lipide enthalten, damit das Lösungsmittel nicht verdunstet und dadurch die Konzentration verändern. Die Durchstechflasche mit Aluminiumfolie umwickeln, um DiI vor Licht zu schützen, und lassen Sie die Probe über Nacht im Trockenhaus, um das Chloroform zu verdampfen. Lösen Sie am nächsten Tag die ausgetrocknete Probe in absolutem Ethanol auf, um ein Endvolumen von 1,2 Millilitern zu erreichen.
Diese Lösung stellt die organische Phase dar. Nehmen Sie eine 12 Milliliter Glasdurchstechflasche und füllen Sie sie mit neun Milliliter gereinigtem Wasser. Dann fügen Sie einen magnetischen Floh in die Durchstechflasche mit neun Milliliter Wasser.
Die Durchstechflasche auf einen Magnetrührer legen und bei 500 Umdrehungen rühren. Als nächstes eine Ein-Milliliter-Glasspritze am Dosiersystem befestigen und mindestens 10 Mal chloroform in und aus der Glasspritze ziehen. Geben Sie die Chloroform jedes Mal in ihren Abfallsammler.
Die Reinigung der Spritze mit Chloroform hilft, Verunreinigungen zu vermeiden. Jetzt die Spritze mit Ethanol primen. Die Grundierung ersetzt das alte Lösungsmittel und entfernt Luftblasen.
Mit der Spritze einen Milliliter der organischen Phase ansaugen und die Spritze bis zur Mitte der Neun-Milliliter-Wassermarke in die Glasflasche einlegen. Halten Sie es in der Mitte der Durchstechflasche stabil und injizieren Sie die Lösung mit 833 Mikroliterpro Sekunde, indem Sie den Dosierknopf am Dosiersystem drücken. Dadurch entstehen 10 Mikroliter von 50 mikromolaren lipidbeschichteten Nanopartikeln von Falcarindiol in 10% Ethanol.
Diese Injektionsgeschwindigkeit wurde gefunden, um feinste Nanopartikel mit schmaler Partikelgrößenverteilung zu erreichen. Während der Injektion ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Nadel in der Mitte, stetig und gerade eingesetzt wird. Unmittelbar nach der Injektion die Durchstechflasche aus dem Rührwerk nehmen und die Probe in einen 50 Milliliter runden Bodenkolben geben.
Greifen Sie den Kolben auf den Rotationsverdampfer an und verdampfen Sie einen Milliliter des organischen Lösungsmittels bei Raumtemperatur. Seien Sie vorsichtig, um übermäßige Blasenbildung zu vermeiden. Übertragen Sie die Nanopartikelsuspension aus dem Kolben in eine weitere 12-Milliliter-Glasflasche.
Stellen Sie sicher, dass das Volumen neun Milliliter beträgt, und teilen Sie die Probe dann in zwei 12 Milliliter Glasfläschchen auf. Dann fügen Sie 0,5 Milliliter ultrareines Wasser in eine der Fläschchen und 0,5 Milliliter 10X Phosphat gepufferte Salzsäure in der anderen Durchstechflasche. Schalten Sie das digitale Lichtstreuungsinstrument ein und stellen Sie die gewünschte Temperatur auf 20 Grad Celsius ein, bis sie sich stabilisiert.
Legen Sie dann die Geräteparameter wie hier gezeigt fest. Füllen Sie die Kunststoffküvette mit einem Milliliter Nanopartikelsuspension, und starten Sie die Messung. Melden Sie die gemessene Größe in Abhängigkeit von dem verwendeten Lösungsmittel.
Samen ca. 50.000 Zellen auf sterilen 1,5 Abdeckung Suple in Sechs-Well-Platte platziert, um eine Zelldichte von etwa 30% zu erhalten Dann fügen Sie Kulturmedium, um ein endgültiges Volumen von drei Milliliter in jedem Brunnen haben. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang unter Standardkulturbedingungen. Am nächsten Tag drei Mikroliter der Nanopartikellösung für eine endgültige Falcarindiol-Konzentration von fünf Mikromolaren hinzufügen.
Dann geben Sie die Zellen für 24 Stunden in den Inkubator zurück. Waschen Sie die Zellen nach 24 Stunden Behandlung zweimal mit PBS und fixieren Sie sie dann 10 Minuten bei Raumtemperatur in 4%Formaldehyd. Nach der Fixierung, permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1%Triton X-100 für 30 Minuten.
Dann waschen Sie sie zweimal mit PBS, und färben Sie sie mit 250 Mikroliter 300 Nanomolar DAPI für fünf Minuten, vor Licht geschützt. Legen Sie den Deckelschlupf mit einem Drop PBS auf eine Folie. Wenden Sie sich einer 150-fachen subjektiven Und übertragen Sie die Folie auf die Stufe eines Weitfeldfluoreszenzmikroskops, das mit einer elektronenmultiplizierten CCD-Kamera ausgestattet ist.
Bildzellen mit dem GFP-LP-Kanal. Überprüfen Sie außerdem die Aufnahme der Nanopartikel in die Zellen, indem Sie konfokale Mikroskopiebilder mit einem 63-fachen Ölobjektiv mit einer numerischen Blende von 1,4 aufnehmen. Bild DiI mit einem Argonlaser mit 514 Nanometern und DAPI mit einem Zwei-Photonen-Laser bei 780 Nanometern.
Unbeschichtete Nanopartikel von Falcarindiol, die in Wasser gebildet und in PBS gemessen wurden, zeigten eine hohe Polydisperität mit einem PD-Index von 0,571. Dieser Wert gibt eine breite und ungleichmäßige Verteilung der Partikelgrößen an. Im Gegensatz dazu waren die in diesem Video hergestellten lipidbeschichteten Nanopartikel von Falcarindiol von 74,1 Nanometern mit einem Polydispersitätsindex von 0,182, was auf eine relativ monodisperse und gleichmäßige Verteilung der Partikelgrößen hindeutete.
Als erste Beobachtung der Nanopartikel in den Zellen wurden nach 24 Stunden Behandlung Epifluoreszenzmikroskopiebilder aufgenommen. Die Nanopartikel wurden als weiße, helle Punkte visualisiert, und es könnte vermutet werden, dass sich Nanopartikel in den Zellen, die den Kern umgeben, befanden. Um zu überprüfen, ob Falcarindiol-Nanopartikel in die Zellen eingedrungen waren, wurde auch eine konfokale Mikroskopie an den Zellen durchgeführt.
Hier wird eine große Anzahl von Nanopartikeln gezeigt, die im Zytoplasma in jeder Zelle verstreut sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass Nanopartikel als stabiles Arzneimittelabgabesystem für Falcarindiol fungieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Lösung mit der richtigen Injektionsgeschwindigkeit zu injizieren, wobei die Aussaat in der Mitte stabil bleibt, um eine ordnungsgemäße Durchmischung zu gewährleisten.
Dieses Verfahren kann für jedes hydrophobe Medikament verwendet werden, um therapeutische Nanopartikel zu formulieren, oder für bildgebende Mittel, um diagnostische Nanopartikel zu formulieren, die unter verschiedenen Krankheiten wie Krebs verwendet werden können. Diese Technik ermöglichte es, mehr Forschung über den Mechanismus durchzuführen, durch den die Nanopartikel von den Zellen aufgenommen werden, sowie seine Live-Zell-Bildgebung und die Untersuchung der Krebswirkung des Medikaments.
