La fabrication de nanoparticules enduites de lipides avec la méthode d’injection rapide fournit un système stable d’administration de médicaments pour la thérapie contre le cancer. Cette technique est une technique simple, rapide, évolutive et reproductible pour la fabrication de nanoparticules qui encapsule les médicaments hydrophobes. Cette technique est applicable pour la fabrication de nanoparticules diagnostiques et thérapeutiques à partir de matériaux hydrphobes qui peuvent être efficacement utilisés dans plusieurs conditions de la maladie.
Cette technique de fabrication, avec DLS, peut être utilisée pour étudier la nucléation et la croissance des matériaux hydrophobes, tels que les lipides, les protéines et les polymères. Connaître les propriétés chimiques physiques de votre substance médicamenteuse est essentiel avant de fabriquer les nanoparticules. En outre, assurez-vous d’utiliser les concentrations correctes de lipides de revêtement.
La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour montrer la simplicité de la technique de fabrication et pour montrer la livraison réussie du médicament comme nanoparticules aux cellules. Il faut prendre des précautions lorsqu’on travaille avec du chloroforme et du formaldéhyde, et il faut travailler sous un capot de fumée. Pour commencer, distribuez 2,4 millilitres de 250 micromolaires falcarindiol solution de stock dissous dans 70% d’éthanol dans un flacon de scintillation.
À l’aide d’un concentrateur d’échantillon, évaporer la fraction liquide pendant environ quatre heures pour obtenir du falcarindiol sec. À l’aide du concentrateur de l’échantillon, livrer le gaz sur l’échantillon à température ambiante pour concentrer l’échantillon. Une fois séché, ajouter les composants indiqués ici au flacon de scintillation dans un capot de fumée, en s’assurant de nettoyer la seringue avec du chloroforme après avoir ajouté chaque composant pour éviter la contamination croisée.
Fermez immédiatement les flacons contenant les lipides afin que le solvant ne s’évapore pas et modifie ainsi la concentration. Envelopper le flacon de papier d’aluminium pour protéger DiI de la lumière et laisser l’échantillon pendant la nuit dans le desiccateur pour évaporer le chloroforme. Le lendemain, dissoudre l’échantillon desséché dans de l’éthanol absolu pour faire un volume final de 1,2 millilitres.
Cette solution représente la phase organique. Prenez un flacon de verre de 12 millilitres et remplissez-le de neuf millilitres d’eau purifiée. Ajouter ensuite une puce magnétique dans le flacon contenant neuf millilitres d’eau.
Placer le flacon sur un agitateur magnétique et remuer à 500 r/h. Ensuite, fixez une seringue en verre d’un millilitre au système de distribution et tirez lentement le chloroforme dans et hors de la seringue en verre au moins 10 fois. Distribuez le chloroforme dans son collecteur de déchets à chaque fois.
Le nettoyage de la seringue avec du chloroforme permet d’éviter toute contamination. Maintenant, amorcer la seringue avec de l’éthanol. L’amorçage remplace l’ancien solvant et élimine les bulles d’air.
À l’aide de la seringue, aspirer un millilitre de la phase organique et insérer la seringue dans le flacon de verre jusqu’au milieu de la marque d’eau de neuf millilitres. Maintenez-le stable au milieu du flacon, et injectez la solution à 833 microlitres par seconde en appuyant sur le bouton de distribution sur le système de distribution. Cela génère 10 microlitres de 50 nanoparticules enrobées de lipides micromolaires de falcarindiol dans 10% d’éthanol.
Cette vitesse d’injection s’est trouvée pour atteindre les nanoparticules les plus fines avec la distribution étroite de taille de particule. Lors de l’injection, il est important de s’assurer que l’aiguille est insérée au centre, stable et droite. Immédiatement après l’injection, retirer le flacon de l’agitateur et transférer l’échantillon dans un flacon de fond rond de 50 millilitres.
Attaquez le flacon jusqu’à l’évaporateur rotatif et évaporez un millilitre du solvant organique à température ambiante. Soyez prudent pour éviter la formation excessive de bulles. Transférer la suspension nanoparticule du flacon dans un autre flacon de verre de 12 millilitres.
Assurez-vous que le volume est de neuf millilitres, puis divisez l’échantillon en deux flacons de verre de 12 millilitres. Ajouter ensuite 0,5 millilitres d’eau ultra pure dans l’un des flacons et 0,5 millilitre de saline tamponnée de phosphate de 10 X dans l’autre flacon. Allumez l’instrument numérique de diffusion de la lumière et réglez la température désirée à 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle se stabilise.
Réglez ensuite les paramètres de l’instrument tels qu’ils sont indiqués ici. Remplissez la cuvette en plastique d’un millilitre de suspension nanoparticule et commencez la mesure. Indiquez la taille mesurée en fonction du solvant utilisé.
Ensemencer environ 50 000 cellules sur des glissements stériles de 1,5 couvercle placés dans une plaque de six puits pour obtenir une densité cellulaire d’environ 30 %, puis ajouter le milieu de culture afin d’avoir un volume final de trois millilitres dans chaque puits. Incuber les cellules pendant 24 heures dans des conditions de culture standard. Le lendemain, ajouter trois microlitres de la solution nanoparticule pour une concentration finale de falcarindiol de cinq micromolaires.
Ensuite, retournez les cellules à l’incubateur pendant 24 heures. Après 24 heures de traitement, lavez les cellules deux fois avec du PBS, puis fixez-les en formaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes à température ambiante. Après fixation, perméabiliser les cellules avec 0,1%Triton X-100 pendant 30 minutes.
Ensuite, lavez-les deux fois avec PBS, et les tacher avec 250 microlitres de 300 nanomolaires DAPI pendant cinq minutes, protégés de la lumière. Placez le slip de couverture sur une glissière à l’aide d’une goutte de PBS. Tournez-vous vers un 150x subjectif, et transférez la diapositive au stade d’un microscope à fluorescence à champ large équipé d’une caméra CCD multipliée par électrons.
Cellules d’image utilisant le canal GFP-LP. En outre, vérifiez l’absorption des nanoparticules dans les cellules en prenant des images de microscopie confocales à l’aide d’un objectif d’huile 63x avec une ouverture numérique de 1,4. Image DiI à l’aide d’un laser argon à 514 nanomètres et DAPI à l’aide d’un laser à deux photons à 780 nanomètres.
Les nanoparticules non encoated du falcarindiol formées dans l’eau et mesurées dans PBS ont montré la polydispersité élevée, avec l’index de de 0.571. Cette valeur indique une distribution large et non uniforme de la taille des particules. En revanche, les nanoparticules enduites de lipides de falcarindiol fabriquées dans cette vidéo étaient de 74,1 nanomètres avec un indice de polydispersité de 0,182, a indiqué une distribution relativement monodisperse et uniforme des tailles de particules.
Comme première observation des nanoparticules à l’intérieur des cellules, des images de microscopie d’épifluorescence ont été acquises après 24 heures de traitement. Les nanoparticules ont été visualisées comme des points blancs et lumineux, et on pourrait émettre l’hypothèse que les nanoparticules étaient situées à l’intérieur des cellules entourant le noyau. Pour vérifier que des nanoparticules de falcarindiol étaient entrées dans les cellules, la microscopie confoccale a été exécutée sur les cellules aussi bien.
Un grand nombre de nanoparticules sont montrées ici, dispersées dans le cytoplasme dans chaque cellule. Ces résultats montrent que les nanoparticules agissent comme un système stable d’administration de médicaments pour le falcarindiol. Tout en essayant cette procédure, il est important d’injecter la solution à la bonne vitesse d’injection, en gardant l’ensemencement stable, au centre, pour assurer un bon mélange.
Cette procédure peut être utilisée pour n’importe quel médicament hydrophobe pour formuler des nanoparticules thérapeutiques ou pour les agents d’imagerie pour formuler des nanoparticules diagnostiques qui peuvent être utilisées dans diverses conditions de la maladie, comme le cancer. Cette technique a permis de mener davantage de recherches sur le mécanisme par lequel les nanoparticules sont prises en charge par les cellules, ainsi que sur l’imagerie cellulaire vivante et sur l’étude de l’effet anticancéreux du médicament.
