Hızlı enjeksiyon yöntemi ile lipid kaplı nano tanecikleri imalatı kanser tedavisi için istikrarlı bir ilaç dağıtım sistemi sağlar. Bu teknik hidrofobik ilaçları kapsülleyen nanopartikül üretimi için basit, hızlı, ölçeklenebilir ve tekrarlanabilir bir tekniktir. Bu teknik etkili çeşitli hastalık koşullarında kullanılabilir hydrphobic malzemelerden tanı ve tedavi nano tanecikleri imal etmek için geçerlidir.
Bu üretim tekniği, DLS ile birlikte, lipidler, proteinler ve polimerler gibi hidrofobik maddelerin çekirdekleşme ve büyümesini incelemek için kullanılabilir. Nano tanecikleri imal etmeden önce ilaç maddenizin fiziksel kimyasal özelliklerini bilmek çok önemlidir. Ayrıca, kaplama lipidlerin doğru konsantrasyonlarını kullandığınızdan emin olun.
Bu yöntemin görsel gösteri ve üretim tekniğinin basitliğini göstermek için hücrelere nano tanecikleri olarak ilacın başarılı teslim göstermek için önemlidir. Kloroform ve formaldehit ile çalışırken önlem alınması ve duman başlığı altında çalışma yapılması gerekmektedir. Başlamak için, 250 mikromolar falkarindiol stok çözeltisi 2.4 mililitre dağıtmak bir Scintillation vial% 70 etanol içinde çözünmüş.
Bir örnek konsantratörü kullanarak, kuru falkarindiol elde etmek için yaklaşık dört saat boyunca sıvı fraksiyonu buharlaşır. Numune konsantratörü kullanarak, numuneyi yoğunlaştırmak için oda sıcaklığında numunenin üzerine gaz verin. Kuruduktan sonra, burada gösterilen bileşenleri duman kaputundaki ışıltılı şişeye ekleyin ve çapraz kontaminasyonu önlemek için her bileşeni ekledikten sonra şırınganın kloroformla temizlediğinden emin olun.
Daha sonra, çözücünün buharlaşmaması ve böylece konsantrasyonu değiştirmesi için lipitleri içeren şişeleri hemen kapatın. Işıktan DiI korumak için alüminyum folyo ile şişe sarın ve kloroform buharlaştırmak için kurutucu bir gecede örnek bırakın. Ertesi gün, 1.2 mililitre son bir hacim yapmak için mutlak etanol kurutulmuş örnek eritin.
Bu çözelti organik fazı temsil eder. 12 mililitrelik bir cam şişe alın ve dokuz mililitre saf su yla doldurun. Sonra su dokuz mililitre içeren şişe içine bir manyetik pire ekleyin.
Bir manyetik karıştırıcı üzerine şişe yerleştirin ve 500 rpm karıştırın. Sonra dağıtım sistemine bir mililitrelik cam şırınga takın ve kloroform'u cam şırınganın içine ve dışına en az 10 kez girip çıkar. Kloroformu her seferinde atık toplayıcısına dağıtın.
Şırıngayı kloroformla temizlemek herhangi bir kontaminasyonu önlemeye yardımcı olur. Şimdi şırıngayı etanolle aç. Astar eski çözücü nün yerini alır ve hava kabarcıklarını temizler.
Şırıngayı kullanarak, organik fazın bir mililitreaspire, ve dokuz mililitre su işareti nin ortasına kadar cam şişe içine şırınga yerleştirin. Şişenin ortasında sabit olarak saklayın ve dağıtım sistemindeki dağıtım düğmesine basarak çözeltiyi saniyede 833 mikrolitreye enjekte edin. Bu% 10 etanol falkarindiol 50 mikromolar lipid kaplı nano tanecikleri 10 mikrolitre üretir.
Bu enjeksiyon hızı dar parçacık boyutu dağılımı ile en iyi nano tanecikleri elde etmek için bulunmuştur. Enjeksiyon sırasında, iğnenin merkeze sabit ve düz olarak yerleştirildiğinden emin olmak önemlidir. Enjeksiyondan hemen sonra, şişeyi karıştırıcıdan çıkarın ve numuneyi 50 mililitrelik yuvarlak alt şişeye aktarın.
Şişeye döner evaporatöre saldırın ve oda sıcaklığında bir mililitre organik çözücü buharlaşın. Aşırı kabarcık oluşumunu önlemek için dikkatli olun. Nanopartikül süspansiyonu şişeden 12 mililitrelik cam şişeye aktarın.
Hacmin dokuz mililitre olduğundan emin olun ve ardından numuneyi iki 12 mililitrelik cam şişeye bölün. Daha sonra şişelerden birine 0,5 mililitre ultra saf su ve diğer şişede 10 X fosfat tamponlu 0,5 mililitre saf su ekleyin. Dijital ışık saçılma aletini açın ve istenilen sıcaklığı stabilize olana kadar 20 dereceye ayarlayın.
Daha sonra burada gösterildiği gibi enstrüman parametrelerini ayarlayın. Plastik cuvette'yi bir mililitre nanopartikül süspansiyonla doldurun ve ölçüme başlayın. Kullanılan çözücüye bağlı olarak ölçülen boyutu bildirin.
Yaklaşık %30'luk bir hücre yoğunluğu elde etmek için altı kuyulu tabağa yerleştirilen steril 1,5 kapak lı yaklaşık 50.000 hücre tohumu daha sonra her kuyuda üç mililitrelik son bir hacim için kültür ortamı ekleyin. Standart kültür koşullarında hücreleri 24 saat kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, beş mikromolar son bir falkarindiol konsantrasyonu için nanopartikül çözeltisi üç mikrolitre ekleyin.
Sonra hücreleri 24 saat boyunca kuvöze geri ver. Tedaviden sonra, pbs ile iki kez hücreleri yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 4 formaldehit onları düzeltmek. Fiksasyondan sonra, hücreleri 30 dakika boyunca %0.1 Triton X-100 ile geçirin.
Daha sonra pbs ile iki kez yıkayın ve ışıktan korunan, beş dakika boyunca 300 nanomolar DAPI 250 mikrolitre ile leke. Bir damla PBS kullanarak kapak fişini slayta yerleştirin. 150x öznel bir ortama dönün ve slaytı elektron la çarpılmış ccd kamera ile donatılmış geniş alan floresan mikroskobu aşamasına aktarın.
GFP-LP kanalını kullanarak görüntü hücreleri. Ayrıca, 1.4 sayısal diyafram ile 63x yağ hedefi kullanarak konfokal mikroskopi görüntüleri alarak hücrelere nano tanecikleri alımını doğrulayın. Görüntü DiI 514 nanometre ve DAPI 780 nanometre de iki foton lazer kullanarak bir argon lazer kullanarak.
Suda oluşan ve PBS cinsinden ölçülen falkarindiolun kaplamasız nano partikülleri, 0,571 PD indeksi ile yüksek polidispersitlik gösterdi. Bu değer, parçacık boyutlarının geniş ve tek düze olmayan dağılımını gösterir. Buna karşılık, bu videoda üretilen falkarindiol lipid kaplı nano tanecikleri 0.182 polidispersity indeksi ile 74.1 nanometre, parçacık boyutları nispeten monodisperse ve tektip dağılımı gösterdi.
Hücrelerin içindeki nano partiküllerin ilk gözlemi olarak epifloresan mikroskopi görüntüleri 24 saatlik tedaviden sonra elde edildi. Nano tanecikler beyaz, parlak nokta olarak görselleştirildi ve nano partiküllerin çekirdeği çevreleyen hücrelerin içinde olduğu varsayımına varılabilirdi. Falkarindiol nano partiküllerinin hücrelere girdiğini doğrulamak için hücrelere konfokal mikroskopi de yapıldı.
Nano tanecikleri çok sayıda burada, her hücrede sitoplazma da dağınık gösterilir. Bu sonuçlar nano tanecikleri falkarindiol için istikrarlı bir ilaç dağıtım sistemi olarak hareket göstermektedir. Bu prosedürü çalışırken, doğru karıştırma sağlamak için, merkezinde, tohumlama sabit tutarak, doğru enjeksiyon hızında çözüm enjekte etmek önemlidir.
Bu prosedür terapötik nano tanecikleri formüle etmek için herhangi bir hidrofobik ilaç için veya kanser gibi çeşitli hastalık koşullarında kullanılabilecek tanısal nano tanecikleri formüle görüntüleme ajanları için kullanılabilir. Bu teknik, nano partiküllerin hücreler tarafından ele geçirilme mekanizması, canlı hücre görüntülemesi ve ilacın antikanser etkisini inceleme konusunda daha fazla araştırma yapılmasını sağladı.
