Las esporas bacterianas vivas que muestran antígeno o enzimas son nanopartículas funcionalmente activas que se pueden utilizar como vacunas mucosas o biocatalísticas. En principio, cualquier proteína puede ser absorbida eficientemente a las esporas. Esta técnica es simple y no requiere ninguna manipulación genética.
Por lo tanto, no hay ninguna liberación de organismos recombinantes en el medio ambiente está involucrado. Además de la vacuna mucosa para humanos y animales, las esporas que muestran enzimas se pueden desarrollar como biocatalizadores reutilizables. Comience por etiquetar dos veces 10 a la novena esporas purificadas de tipo B.subtilis con concentraciones de dos o 10 microgramos del modelo RFP en 200 microlitros de tampón de unión complementados con citrato de sodio de 50 mililitrolares durante una hora a 25 grados Celsius en una coctelera mecedora.
Al final de la incubación, pele el pellet de las mezclas de unión por centrifugación, y transferir los sobrenadantes a nuevos tubos cónicos para el análisis posterior de la eficiencia de adsorción. A continuación, lave los pellets de esporas dos veces con 200 microlitros de tampón de unión por lavado, resuspmentando los pellets en 100 microlitros de tampón de unión fresca después del segundo lavado. Para la extracción de proteínas superficiales, agregue 50 microlitros de cada resuspensión de esporas adsorbidas a 50 microlitros de 2X dodecyl sulfato-ditiothreitol sódico para solubilizar las proteínas de esporas superficiales.
Después de 45 minutos a 65 grados Celsius, recoger las mezclas por centrifugación, y ejecutar 10 microlitros de cada volumen de proteínas extraídas sobrenadante en una mancha occidental, utilizando un anticuerpo anti-Su monoclonal que reconoce la etiqueta Su presente en el N-terminus de mRFP para identificar las proteínas superficiales etiquetadas. Para localizar y cuantificar las moléculas adsorbidas mediante microscopía de fluorescencia, agregue cinco microlitros de la resuspensión de esporas adsorbidas a 95 microlitros de PBS, y agregue cinco microlitros de cada suspensión resultante en diapositivas de microscopio individuales. Coloque un cubreobjetos tratados con poli-L-lisina en cada diapositiva y coloque una diapositiva en una etapa del microscopio de fluorescencia.
A continuación, para cada campo, guarde las imágenes de microscopía de contraste de fase y fluorescencia. Para el análisis de imágenes, abra las imágenes de microscopía de fluorescencia en ImageJ y seleccione Imagen y Tipo para confirmar que todas las imágenes están en formato de ocho bits. En el menú Analizar, seleccione Establecer medidas y confirme que el área, la densidad integrada y el valor gris medio están seleccionados.
Utilice una herramienta de dibujo o selección para dibujar una línea alrededor de la espora de interés y seleccione Medir en el menú Analizar. Aparecerá un cuadro emergente con una pila de valores para la espora seleccionada. Después de seleccionar al menos 50 esporas, seleccione varias regiones sin esporas y repita la medición para obtener una lectura para la fluorescencia de fondo.
Después de obtener varias mediciones de fondo, copie todos los datos de la ventana Resultados en una hoja de cálculo y calcule la media de la densidad integrada en el área de las esporas seleccionadas y los valores de fluorescencia de fondo para obtener la fluorescencia total por celda corregida. Para la evaluación indirecta de la eficiencia de la adsorción, realice seis diluciones seriales dobles de MRFP purificada a una concentración de 0,5 nanogramos por microlitro a un volumen final de 250 microlitros por dilución en búfer de unión y un número experimental adecuado de diluciones seriales dobles de 100 microlitros de cada muestra de sobrenadante reservada que contenga la fracción mRFP no enlazada de la reacción de adsorción con 100 microlitros de búfer de unión por dilución. A continuación, corte una membrana de nitrocelulosa con un límite de 0,45 micrómetros a un tamaño de nueve por 10 centímetros, para cubrir un área de cinco muestras por seis puntos de dilución sin extenderse más allá del borde de la junta del aparato de punto blot.
Coloque la membrana precoja en el aparato de manchas de puntos. Compruebe el tamaño correcto de la membrana y elimine las burbujas de aire atrapadas entre la membrana y la junta. Montar el aparato de manchas de puntos como se describe por el fabricante, y cubrir la porción no utilizada del aparato para evitar que el aire se mueva a través de esos pozos.
Cuando el aparato esté listo, cargue el estándar en los dos carriles más externos y las muestras en los carriles centrales con 100 microlitros de cada dilución apropiada por pozo. Cuando se hayan cargado todas las muestras, encienda la bomba de vacío durante dos minutos, antes de detener el vacío y permitir que las muestras se filtren a través de la membrana por gravedad. Después de 10 minutos, lave cada pozo con 100 microlitros de PBS.
Ejecute la bomba de vacío durante otros cinco minutos. Cuando el tampón de lavado se haya drenado completamente del aparato, mientras el vacío está encendido, afloje los tornillos y abra cuidadosamente el aparato de manchas de puntos. A continuación, procese la membrana de acuerdo con los protocolos de manchas occidentales estándar.
Para el análisis densitométrico del filtro, abra ImageJ y delinee cada punto para medir la densidad integrada utilizando el comando Analizar, Medir como se ha demostrado. Para realizar una corrección de fondo de la imagen, dibuje un círculo en un área vacía y mida su densidad integrada como se ha demostrado. Correlacione la densidad integrada de los puntos estándar con la cantidad de proteína cargada para obtener una línea de calibración, y utilice la curva de calibración para extrapolar la concentración de mRFP de cada punto de muestra.
A continuación, se puede calcular la concentración del mRFP restante en las fracciones no enlazadas. La presencia de proteínas del tamaño esperado sólo en los carriles cargados con un extracto de las esporas adsorbidas es indicativa de una reacción de adsorción exitosa. La evaluación directa de la eficiencia de adsorción depende de la proteína heteróloga que se ha utilizado y se puede realizar mediante microscopía de fluorescencia y citofluorimetría de la fracción de pellet después de la fracción de la reacción de adsorción.
La cuantificación de las señales fluorescentes presentes en las esporas se puede realizar utilizando ImageJ como se ha demostrado. Un análisis indirecto de la eficiencia de adsorción se puede realizar mediante un análisis de la hinchazón de puntos de la fracción sobrenadante que contiene la proteína no unida, y el posterior análisis densitométrico de la proteína no unida permite el cálculo indirecto de la cantidad de proteína adsorbida en las esporas. Aunque, en principio, cualquier proteína puede ser adsorbida para su uso como vacunas mucosas o biocatalistas, en la práctica la eficiencia de la adsorción depende de los sitios de proteínas y propiedades químicas.
