Este procedimiento permite a los investigadores evaluar y seleccionar nanopartículas óptimas para estudios en animales grandes y ensayos clínicos. Este sencillo método ayuda a determinar si la nanopartícula puede dirigirse a las células cancerosas humanas in vivo y, si es así, cuán eficiente es la focalización. Demostrando los procedimientos estarán el Dr.Xiodan Qin, un postdoctorado, y el Sr. Andrew Lam, un técnico de investigación de nuestro laboratorio.
Llene dos tanques de apareamiento de cámara con agua de pescado por la noche y separe los tanques superiores usando divisores. Coloque un pez cebra macho en un lado de la cámara y una o dos hembras de pez cebra en otro lado de la cámara. Retire los divisores a las 8:00 AM de la mañana siguiente.
Agregue plantas de enriquecimiento artificial e incline ligeramente la cámara superior para crear un área poco profunda de agua. Permita que el pez cebra se reproduzca durante tres a cuatro horas y recoja los huevos de la cámara inferior vertiendo el agua a través de una red de malla. Transfiera los huevos a un plato de Petri con no más de 200 huevos por plato.
Retire los huevos muertos o no fecalizados. Llene el plato dos tercios lleno con agua fresca de pescado y colóquelo en la incubadora. Después de 24 horas, retire el plato de la incubadora y retire la mayor cantidad de agua posible del plato.
Agregue unas gotas de una solución de pronasa de miligramo por mililitro y revuelva suavemente el plato. Cuando los coros muestran signos de desintegración, pipetea los embriones hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para descomponer los coros y liberar los embriones. Una vez que la mayoría de los embriones están fuera de los coros, agregue inmediatamente agua fresca de pescado para terminar el proceso.
Enjuague los embriones con agua de pescado tres veces para eliminar las corocciones flotantes Devolver los embriones a la incubadora. Haga una solución de 3% de agarosa añadiendo tres gramos de agarosa de grado electroforesis a 100 mililitros de agua de pescado autoclaved. Microondas la agarosa y el agua hasta que la agarosa se disuelva por completo.
Para crear la placa de inyección, vierta la solución de agarosa caliente en un plato de Petri hasta que esté tres cuartos de lleno y coloque el molde de inyección micro en la agarosa. Después de que la agarosa se haya solidificado, retire cuidadosamente el molde. Llene la placa de inyección resultante con agua de pescado autoclavizada y guárdela a cuatro grados centígrados.
Para fabricar las agujas de inyección, tire de los capilares de vidrio borosilicato de un milímetro de diámetro exterior por 0,78 milímetros en un tirador de pipetas. Guarde las agujas de inyección en la masilla en un plato grande de Petri que haya sido limpiado con una toalla de etanol. Antes de cosechar las células de HeLa, vuelva a calentar la placa de inyección y el agua de los peces en la incubadora a 35,5 grados centígrados.
30 minutos a una hora antes del trasplante, cosechar las células de HeLa. Trabajando en una capucha de cultivo de tejido, retire el medio del matraz por aspiración. Enjuague las células con PBS estéril para eliminar todos los restos del medio.
Añadir tres mililitros de trippsina estéril EDTA al matraz e incubarlo a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. Observe el matraz bajo el microscopio para monitorear el progreso de la digestión enzimática. Cuando aproximadamente el 80% de las células están suspendidas, agregue de seis a ocho mililitros de medio de crecimiento al matraz.
Recoger las células pipeteando suavemente y transferirlas a un tubo estéril de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 135 veces G durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células de HeLa en tres mililitros de medio de crecimiento completo.
Después de repetir los pasos de lavado dos veces, resuspender las células en un mililitro de medio de crecimiento completo. Luego cuente las células bajo el microscopio usando un hemocicómetro. Después de centrifugar las células de nuevo, retire el sobrenadante.
Resuspender las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros a una concentración de cinco veces 10 a las séptimas células por mililitro. Mantenga las células calientes sosteniendo el tubo en una mano cuando se transporta a la instalación de peces. Con una pipeta de plástico, coloque los embriones de pez cebra en la placa de inyección.
Poner embriones en sus lados con la cara anterior hacia adelante alineada con las ranuras en la placa. Encienda la fuente de aire y el microinyector. Después de recuperar las células HeLa de la incubadora, pipetee las células hacia arriba y hacia abajo 20 a 30 veces usando un P200.
Usando una punta de carga de gel con un extremo cortado, cargue inmediatamente tres microlitros de la suspensión celular de HeLa en una de las agujas de inyección. Inserte la aguja en el soporte de la aguja y coloque la placa de inyección debajo del microscopio. Inyectar la mezcla celular en el embrión en el área vascularizada debajo de la cavidad de la perivitellina presionando el pedal.
A continuación, pipetear unas gotas de agua estéril de pescado en el embrión. Para continuar con el proceso de inyección, utilice la mano no dominante para mover la placa de inyección al siguiente embrión, y luego utilice la mano dominante para extender y retraer el inyector mientras presiona simultáneamente el pedal. Termine la inyección de todos los embriones en la placa y lave los embriones con agua estéril de pescado en un plato estéril de Petri.
Incubar inmediatamente el plato a 35,5 grados centígrados. Después de tres horas, examine los embriones inyectados y retire los muertos. Al día siguiente, haz agujas de inyección para las nanopartículas y guárdalas en masilla en un plato grande de Petri.
Trabajando bajo un microscopio fluorescente, recoja cuidadosamente embriones con metástasis de cola y colóquelos en una nueva placa de inyección con agua estéril de pescado. Para cada pez cebra con una metástasis de cola, inyecte una solución de nanopartículas o agua detrás del ojo. También inyectar nanopartículas detrás de los ojos del pez cebra en el grupo de control que no recibió trasplantes de HeLa e incubar todos los embriones inyectados a 35,5 grados centígrados.
Inmediatamente después de la inyección y de nuevo a intervalos de 30 a 60 minutos, transfiera de dos a tres embriones a una placa De Petri e inmovilicelos añadiendo cinco gotas de solución MS222 diluida. Una vez que los embriones dejen de nadar, retire la mayor parte del agua para permitir que los embriones se recuestrán en sus lados. Usando una pipeta con un cepillo delgado y suave unido a su extremo, alinee los embriones para que se recoen con la parte anterior mirando hacia adelante y solo un ojo visible.
Con el aumento 2X, capture imágenes de todo el embrión en canales rojos, azules y Brightfield. Para capturar el área de la cola, imagine los embriones con un aumento de 6,4X. Enfoque el embrión bajo el canal rojo para evitar el sangrado de nanopartículas.
Inmediatamente después de la toma de imágenes, agregue agua fresca de pescado a los embriones y devuélvalos a la incubadora. Los embriones de pez cebra inyectados y de control fueron objeto de imágenes con un microscopio fluorescente. Los puntos rojos son células de cáncer cervical humano metastásicas, mientras que los puntos azules representan las nanopartículas.
En un grupo de control, el pez cebra que se inyectó con células cancerosas pero no con nanopartículas, las células fluorescentes de HeLa eran visibles en el canal rojo y no se detectaron señales fluorescentes específicas en el canal azul. En el otro grupo de control, el pez cebra se inyectó con nanopartículas, pero no con células cancerosas. Las nanopartículas fluorescentes azules se distribuyeron por todo el sistema circulatorio.
No se vio ninguna florescencia roja específica. Cuando se inyectaron peces cebra con metástasis de cola con nanopartículas, las imágenes superpuestas de los canales rojo y azul muestran la co-localización de células de HeLa y nanopartículas. Después de realizar este método, podemos analizar la carga tumoral y la supervivencia de las células cancerosas, los animales con y sin inyectar nanopartículas para ajustar su capacidad de matar células cancerosas.
Esta técnica puede facilitar la selección de la nanopartícula óptima que puede reconocer específicamente la célula cancerosa in vivo que conduce a la detección temprana de cáncer y metástasis oncológica.
