Il nostro laboratorio alla Johns Hopkins ha eseguito piccoli trapianti di reni e fegato di animali con oltre due decenni di esperienza. Questo protocollo specifico delinea i passaggi critici necessari per eseguire con successo il trapianto di rene ortotopico nei ratti. Per aumentare la probabilità e la riproducibilità del successo, il nostro protocollo include tre passaggi distintivi, la perfusione del rene donatore attraverso la vena portale e l'uso di un sistema di polsini per anastomosi le vene renali e gli ureteri.
A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Le Qi, uno studente laureato nel nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, anestetizza il ratto donatore come descritto nel protocollo di testo. Posizionare il topo in posizione supina e immobilizzare gli arti con nastro adesivo sterile.
Applicare un lubrificante per gli occhi e sterilizzare il campo chirurgico come descritto nel protocollo di testo. Prima della prima incisione, assicurarsi che il ratto sia adeguatamente anestetizzato controllando l'assenza del riflesso di prelievo del dito del dito. Usando le forbici, inizia facendo una grande incisione longitudinale della pelle e del muscolo dalla sinfisi pubica allo xifoide ed entra nella cavità peritoneale.
Coprire l'intestino con una garza sterile umida e spostarlo sul lato laterale destro dell'addome esponendo l'aorta, la vena cava e il rene sinistro. Applicare un millilitro di soluzione salina preriscaldata con una siringa da un cc per mantenere l'intestino e gli organi addominali umidi e a temperatura normale. Applicare una seconda garza umida per coprire e mobilitare lo stomaco e la milza cranici sul rene.
Quindi aggiungere una piccola garza umida per coprire il rene esposto. Utilizzare le forcelle di sezionatura microchirurgica per isolare e mobilitare l'arteria renale sinistra e la vena dal tessuto connettivo e l'una dall'altra. Ora isolare la vena renale sinistra cauterizzando la vena gonadale sinistra e isolare l'arteria renale sinistra cauterizzando l'arteria surrenale.
Successivamente, mobilitare l'aorta e la vena cava superior e inferiori alla pedicella renale sinistra sezionando il tessuto connettivo con forcelle sezionanti. Dividere e mobilitare l'uretero dal tessuto connettivo utilizzando le forcelle sezionanti, quindi utilizzare micro forbici per fare un'incisione diagonale ad una lunghezza di circa due centimetri misurata dal bacino renale. Inserire un polsino in poliammide a metà dell'uretero e fissare il polsino posizionando un nodo con 8-0 sutura di seta.
Mobilitare il rene sinistro separarlo dal grasso perineforico usando forcep sezionanti o micro forbici. Lasciare attaccata la capsula adiposa del rene e utilizzare quel sito per la manipolazione del rene. Ora somministrare 200 unità di eparina usando una siringa con un ago calibro 27 attraverso la vena del pene.
Esercitare pressioni sul sito di iniezione con un batuffolo di cotone per almeno un minuto per prevenire il sanguinamento. Identificare la vena porta e la vena cava inferiore. Esponi la vena cava inferiore.
Prepararsi a sciacquare il rene iniettando 50 millilitri di soluzione salina fredda mescolati con 500 unità di eparina nella vena del portale utilizzando un ago calibro 16. Prima dello sciacquone, tagliare la vena cava inferiore a livello infraepatico e tagliare la vena porta caudale nel sito di inserimento dell'ago per consentire al sangue di uscire dalla circolazione. Iniziare a sciacquare il rene infondendo gradualmente la soluzione salina.
Osserva un cambiamento di colore del rene dal rosso scuro a un colore grigio o pallido uniforme. Dopo lo sciacquone, legare l'arteria renale e la vena prossimale all'aorta e alla vena cava. Posizionare il rene lavato in una piastra di Petri contenente salina fredda sul ghiaccio prima di rimuovere il corpo del donatore dal campo chirurgico.
Una volta che il rene è in soluzione salina fredda, fissare e immobilizzare il manico del polsino della vena e tirare delicatamente la vena renale attraverso il polsino. Quindi fissare la vena renale sul polsino posizionando tre nodi usando 8-0 sutura di seta. Per iniziare la procedura ricevente, ripetere i passaggi dalla procedura del donatore fino alla somministrazione di eparina.
Quindi posizionare due morsetti a microvessel atraumatici sull'arteria renale sinistra e sulla vena prossimale all'aorta e alla vena cava. Legare la vena renale ricevente prossimale all'ingresso del rene. Lavare la vena renale con soluzione salina eparinizzata per rimuovere tutto il sangue rimanente dal vaso.
Far scorrere la vena renale legata sulla vena renale ammanettata precedentemente posizionata nel rene donatore. Quindi fissare la vena con un 8-0 sutura di seta. Mantenere lo stesso orientamento posizionale quando si fissa la vena renale sul polsino.
Legare l'arteria renale prossimale all'ingresso del rene ricevente. Sciacquarlo con salina eparinizzata per rimuovere il sangue in eccesso nel vaso. Ora ligate l'uretro a livello del polo inferiore del rene sinistro.
Mobilitare il rene dal grasso perinefrico e rimuovere il rene nativo. Eseguire un'anastomosi end-to-end dell'arteria renale con 8-10 suture interrotte utilizzando una sutura in nylon 10-0. Manovra l'arteria usando lo strato accidentale.
Rimuovere i morsetti del vaso per riavviare la ri-perfusione del rene. Iniziare rimuovendo il morsetto sulla vena seguito dal morsetto sull'arteria. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per aggiungere pressione leggera a qualsiasi area di trasuda intorno alla regione dell'anastomosi.
Pochi minuti dovrebbero essere sufficienti per ottenere un brevetto di anastomosi. Osservare brevemente il rene per valutare per un'adeguata perfusione. Immediatamente dopo la ri-perfusione, il rene dovrebbe cambiare colore e riacquistare gradualmente il suo colore rosso scuro naturale dopo pochi minuti.
A volte si osserva una peristalisi visibile dell'uretro e della produzione di urina in loco. Finire inserendo la punta esposta del polsino ureterale nell'uretero ricevente e fissare l'ureter destinatario con un 8-0 cravatta di seta. Al fine di mantenere in posizione gli ureteri donatori e riceventi, legare le estremità di ciascun lato dell'uretero l'una all'altra.
Opzionalmente, nefrectomizzare il rene destro legando il pedicolo renale con una sutura di seta 3-0. Rimuovere tutte le garze dalla cavità addominale e riportare tutti gli organi nella loro posizione naturale. Quindi spruzzare un millilitro di soluzione salina sull'intestino per mantenerli umidi.
Chiudi l'addome usando una sutura assorbibile 4-0 sul muscolo retto e una sutura di seta 4-0 per chiudere lo strato della pelle in modo interrotto. Mettere l'animale in una gabbia pulita con accesso all'acqua e al cibo ad libitum e consentire il recupero su una pastiglia riscaldante a 37 gradi Celsius. Osservare il recupero per una o due ore prima di riportare l'animale nella struttura animale.
Gli animali con un trapianto di rene sigeneico hanno raggiunto la sopravvivenza a lungo termine senza alcun trattamento immunosoppressivo. Al contrario, gli animali che hanno ricevuto un trapianto di rene allogeneico senza immunosoppressione hanno rifiutato il loro innesto e hanno ceduto all'insufficienza renale con una sopravvivenza mediana di otto giorni. La creatinina sierica media è aumentata modestamente nel gruppo sigeneico, mentre è aumentata di 14 volte nel gruppo allogeneico.
Al momento dell'espianto, la visione macroscopica dell'allografo renale sigeneico non mostrava anomalie. Il colore renale e le strutture interne rimasero intatti. Al contrario, le allografie renali di animali respinti presentarono macchie emorragiche rosse con la distruzione delle strutture interne.
Le macchie di ematossilina ed eosina di innesti sigeneici mostrate sottili anelli capillari glomerulari con un numero normale di cellule endoteliali e mesangiali. Le allografie rifiutate mostravano strutture glomerulari distrutte con segni di infiammazione e tubulite. La colorazione positiva cd8 è stata eseguita per confermare il rifiuto mediato della cella T.
Mentre le allografie sigeneiche mostravano pochissime cellule T positive cd8, le allografie rifiutate mostravano un numero significativamente più elevato di cellule positive CD8 all'interno e intorno ai glomeruli e ai tubuli confermando il rifiuto mediato delle cellule T. Questo modello fornisce una visione significativa dei fenomeni immunologici di rifiuto, tolleranza e interazioni donatore-ospite aprendo la strada allo sviluppo di interventi clinici terapeutici nel trapianto di organi solidi.
