Entre varios protocolos existentes para la preparación de tejidos para la microscopía electrónica de transmisión, seleccionamos métodos que producen una preservación estructural óptima y micrografías de alta resolución para realizar análisis morfométricos de la distribución de vesículas sinápticas en terminales presinápticos. Las imágenes de alto contraste obtenidas con estos métodos permiten cuantificar parámetros como la distancia de las vesículas sinápticas del número de membranas presinápticas de vesículas acopladas a la membrana presináptica y las distancias entre vesículas. Todos estos parámetros son indicativos de la función sináptica.
Dado que las alteraciones en la organización espacial de las vesículas sinápticas pueden estar asociadas con la interrupción de la función sináptica, estos métodos se han utilizado para examinar los efectos de los anestésicos generales en el desarrollo sináptico. Estos métodos también podrían utilizarse para examinar los efectos de cualquier fármaco o tratamiento en la morfología detallada de las sinapsis para proporcionar información sobre su función. Comience preparando el tetróxido de osmio para la fijación posterior de las secciones cerebrales de rata previamente fijadas con paraformaldehído y glutaraldehído a través de perfusión vascular.
Las secciones se vuelven rígidas después del tratamiento con tetróxido de osmio. Por lo tanto, el manejo de los tejidos requiere atención a partir de entonces. Además, antes de agregar osmio, asegúrate de que las secciones estén aplanadas, ya que cualquier pliegue probablemente resultará en fractura de tejido.
Abra una ampolla de vidrio de cinco mililitros de 4%tetróxido de osmio y agua y suéltelo dentro de una botella de vidrio marrón. Agregue cinco mililitros de tampón de fosfato molar 0,2 y luego agregue 10 mililitros adicionales de tampón de fosfato molar 0,1 para lograr una solución final del 1%. Utilice una jeringa de 20 mililitros equipada con una aguja larga para extraer el tetróxido de 1% de osmio y luego agregue el tetróxido de osmio a un frasco de vidrio marrón cubierto con papel de aluminio.
Después de asegurarse de que el espécimen se ha desplegado y aplanado, añada 1%tetróxido de osmio y 0,1 MOLar PB al vial de la muestra. Incubar el espécimen en tetróxido de osmio durante una hora a temperatura ambiente. Extraiga el tetróxido de osmio con un micropipet una vez finalizada la incubación y enjuague las secciones como se describe en el protocolo.
Para preparar el acetato de uranilo, coloque un matraz de vidrio volumétrico de 200 mililitros que contenga 100 mililitros de 70% de etanol en una placa de agitación. Añadir cuatro gramos de acetato de uranilo al matraz, envolver una lámina de aluminio para evitar precipitaciones ligeras y agitar continuamente. Deshidratar las secciones en 50%etanol.
Mancha con el 4%uranyl acetato preparado durante una hora y seguir con deshidratación en serie y enjuague como se describe en el manuscrito. Retire el émbolo de la jeringa de una jeringa de gavage de 60 mililitros y capétalo con una aguja de seguridad. Coloque la jeringa con el lado abierto hacia arriba y agregue cada ingrediente de la mezcla de resina uno por uno.
Finalice añadiendo 525 microlitros de DMP30 con una pipeta. Mover el émbolo de la pipeta muy lentamente como DMP es muy viscoso. Vuelva a colocar el émbolo en la jeringa.
Invierta la jeringa varias veces para mezclar el contenido. El color cambiará de amarillo a ámbar. Evacúe el aire dentro de la jeringa.
A continuación, colóquelo en un balancín con agitación continua durante al menos 30 minutos. Añadir un volumen de resina epoxi y un volumen de acetona a un vial de centelleo y agitar para mezclar. Aplicar este a una resina a la mezcla de acetona en la sección del tejido después del último enjuague de acetona manteniendo cubierto para evitar la evaporación de la acetona.
Retire la mezcla de resina y acetona después de dos a cuatro horas y reemplácela con resina completa e incubar durante cuatro horas. Coloque todos los residuos de resina en un recipiente de recogida debajo de la campana para polimerizar y eliminar más tarde. Cortar dos piezas rectangulares de película de policlorotrifluoroetileno transparente y limpiarlas con 70%etanol.
Recortarlos de modo que haya al menos 1,5 centímetros de plástico libre de tejido en cada lado de la sección, asegurándose de que tienen la misma anchura, pero la altura de la hoja en la parte superior es aproximadamente 2/3 de la hoja inferior. Incline lentamente el vial y utilice un pincel de camello fino y una microespátula flexible para levantar la muestra muy suavemente desde la parte inferior. A continuación, mueva cuidadosamente la sección a lo largo de las paredes del vial y transfiera a la hoja inferior del PCTFE.
Retire el exceso de resina con una microespátula y cubra suavemente la muestra con la hoja superior. Empuje suavemente las burbujas de aire atrapadas sin aplicar presión directa sobre la sección del tejido y limpie el exceso de resina. Utilice una pluma resistente a disolventes para etiquetar las hojas y colóquelas en un horno a 60 grados centígrados durante dos o tres días para polimerizar.
Tire suavemente de las hojas PCTFE empareadas para abrirlas. Utilice una pluma resistente a disolventes para marcar el lado de la hoja que contiene la sección adherente que la marca cerca del tejido. Utilice un punzón de disco para obtener una muestra de círculo de la sección asegurándose de que la marca de la pluma es parte del tejido perforado.
La marca de la pluma brillará cuando la luz brrille en el espécimen. Coloque la tapa de una cápsula de incrustación hacia arriba en un soporte de cápsula. Coloque una gota de resina en la tapa e inserte el disco perforado dentro de la tapa con la sección de tejido hacia arriba.
Inserte una cápsula en la tapa usando un suave movimiento de sacacorchos. Utilice pinzas finas para enrollar e inferiormente una etiqueta de papel impresa de dos centímetros de largo en la cápsula, asegurándose de que se ajuste a la curvatura de las paredes laterales de la cápsula. Vierta la resina embalsada dentro de la cápsula, llene hasta el borde de la cápsula y utilice un palo de madera puntiagudo para empujar la muestra de tejido hasta el fondo.
Coloque la cápsula en el horno a 60 grados centígrados durante dos o tres días para la polimerización. Y luego continuar con la sección y la tinción como se describe en el protocolo. Micrograph electrónico de preservación satisfactoria de la estructura celular neuronal muestra membranas celulares en capas sin roturas.
El citoplasma es finalmente granular y sin espacios vacíos. Las mitocondrias no están hinchadas ni encogidas con una membrana doble externa conservada y cristae interna intacta. La preservación óptima de la ultraestructura neuronal y los detalles morfológicos finos es esencial para visualizar las vesículas sinápticas y medir su distancia con respecto a la membrana presináptica.
Las vesículas sinápticas deben ser distintas y forradas por una sola membrana ininterrumpida. Con el fin de facilitar el análisis morfométrico de la distribución de vesículas sinápticas, las membranas presinápticas y postsinápticas deben ser paralelas en su continuidad preservada. El micrografo electrónico de preservación defectuosa de la estructura tisular muestra la distorsión y rotura de las membranas celulares neuronales y la presencia de espacios extracelulares marcadamente agrandados.
Las mitocondrias parecen distendidas y tienen cristae hinchada. En otro ejemplo de preservación de la estructura tisular defectuosa, había grandes espacios vacíos blancos dentro del citoplasma en lugar de sustancia citoplasma finamente granular con espacios extracelulares agrandados. Una membrana artificial como forall probablemente resultó de la movilización de lípidos durante la fijación con glutaraldehído.
Cuando trabajes tejido cerebral joven, usa 1 tampón de fosfato molar como disolvente para toda tu solución para mantener la tonicidad lo más cerca posible de la del cerebro de rata recién nacido y minimiza la contracción o hinchazón del tejido artefactual. Los micrografías obtenidas con estos métodos se pueden utilizar para estudiar la morfología detallada y las relaciones estructurales dimensionales de una serie de componentes celulares distintos de las vesículas sinápticas. Por ejemplo, mitocondrias, aparatos golgi y cromatina nuclear.
Varios pasos en este protocolo requieren productos químicos que pueden ser tóxicos. Trabaje siempre bajo una campana de humo y use equipo de protección personal cuando manipule aldehídos, osmio, uranio y compuestos de plomo.
