Este protocolo describe el uso de Galleria mellonella como un modelo de infección alternativa para estudiar la tuberculosis, reduciendo el número de modelos de mamíferos utilizados en la investigación. En comparación con los modelos de mamíferos convencionales como los ratones, Galleria mellonella es un modelo más barato, éticamente aceptable y más accesible para estudiar la tuberculosis. Una mayor optimización de este modelo permitirá el cribado de la eficacia y toxicidad de los fármacos antimicobacterianos candidatos y contribuirá al desarrollo de nuevas terapias para la tuberculosis que se necesitan con urgencia.
Galleria mellonella posee un complejo sistema inmune innato comparable al de los mamíferos. El estudio de la interacción huésped-patógeno puede revelar aún más el papel de la inmunidad innata en la tuberculosis. El uso de Galleria mellonella como modelo de infección no se limita a la tuberculosis y ha sido ampliamente utilizado para otros patógenos bacterianos y fúngicos en la última década.
Para empezar, descongelar una reserva de glicerol congelado de 1,2 mililitros de Mycobacterium bovis BCG lux, la cepa de la vacuna de Montreal transformada con el plásmido lanzadera pSMT1 que transporta los genes luxAB. En un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros etiquetado, inocular 15 mililitros de caldo Middlebrook 7H9 con una aliquot descongelada de 1,2 mililitros de BCG lux. Coloque el matraz en un recipiente sellado de bioseguridad e incubar a 37 grados centígrados en una incubadora de agitador orbital a 220 rpm durante 72 horas.
Después de la incubación, preparar 1:10 diluciones del cultivo en solución salina tamponada con fosfato en tubos luminómetros, vórtice, y cargar los tubos del luminómetro en el luminómetro. Cargue el sustrato 1%n-decyl aldehído en etanol absoluto en la plataforma del inyector y mida la bioluminiscencia. Convierta la bioluminiscencia en unidades formadoras de colonias para comprobar el crecimiento del cultivo de lux BCG.
Transfiera el cultivo a un tubo centrífugo y centrífuga a 2, 175 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente para peletizar las células. Deseche el sobrenadante en un desinfectante adecuado con actividad micobactericida conocida. Lavar el pellet celular dos veces en 50 mililitros de PBS-T centrifugando a 2, 175 veces g durante 10 minutos para evitar la acumulación bacteriana.
Después del lavado final, decantar los residuos sobrenadantes y resuspender el pellet de célula micobacteriana en el volumen requerido de PBS-T para diluir la suspensión micobacteriana a la densidad celular deseada. A continuación, prepare diluciones seriales de 10 veces del inóculo en placas de 24 pocillos utilizando PBS-T. Placa 10 microlitros de cada dilución en placas de agar Middlebrook 7H11 en duplicado para enumerar los recuentos de CFU inóculo.
Mantenga las larvas instar compradas en la oscuridad a 18 grados centígrados a su llegada y utilícense dentro de una semana de la compra. Identificar y seleccionar larvas sanas para la experimentación basadas en el color uniforme de la crema, tamaño y peso apropiados, alta motilidad, y poseer la capacidad de derechas cuando se entregan. Usando pinzas de extremo romo, cuente cuidadosamente las larvas sanas en un plato de Petri forrado con una capa de papel de filtro y guárdelo a temperatura ambiente en la oscuridad hasta su uso.
Prepare la plataforma de inyección pegando un papel de filtro circular de 94 milímetros de diámetro en una superficie plana y elevada. Aspirar tres volúmenes de 70% de etanol en una microsinga de 25 microlitros para esterilizar, desechar y enjuagar aún más con tres volúmenes de PBS-T estéril. A continuación, resuspender el inóculo BCG lux preparado y aspirar 10 microlitros en la microsingación esterilizada.
Utilice una jeringa separada para aspirar PBS-T para un control negativo. Después de 10 inyecciones, resuspender el inóculo de lux BCG para garantizar una suspensión celular uniforme. Use pinzas para recoger una larva y colocarla en la plataforma de inyección.
En la plataforma, voltee la larva sobre su espalda e inmovilice asegurando la cabeza y la cola con las pinzas. Localice el último proleg izquierdo, contando hacia abajo desde la cabeza de la larva e inserte cuidadosamente la punta de la aguja de cinco a seis milímetros de profundidad en un ángulo de 10 a 20 grados hasta el plano horizontal. Inyecte el inóculo de la jeringa.
Después de cada infección, transfiera la larva infectada a una placa de Petri forrada con una capa de papel de filtro. Un solo plato Petri de 94 milímetros puede acomodar hasta 30 larvas. Almacene el plato Petri en una caja oscura y ventilada dentro de una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
Monitorear la supervivencia de las larvas cada 24 horas. Las larvas se consideran muertas cuando no se mueven en respuesta al tacto. Registre la supervivencia y evalúe la significancia estadística con la prueba Mantel-Cox.
Cada 24 horas, selecciona al azar cinco larvas infectadas y usa un hisopo de algodón empapado en 70% de etanol para esterilizar suavemente las superficies larvales. Coloque las larvas individualmente en tubos de matriz de dos mililitros que contengan 800 microlitros de PBS estéril. Luego, utilice un homogeneizador para homogeneizar las larvas durante 60 segundos a seis metros por segundo.
Centrifugar los tubos de livalina a 3.500 veces g durante cinco segundos para eliminar el homogeneato de las tapas y decantar cuidadosamente el homogeneizar en cinco tubos de luminómetro estériles individualmente. Reserve 100 microlitros de homogeneizar en un tubo de reacción estéril de 1,5 mililitros. Recuperar cualquier homogeneizado restante lavando los tubos de matriz de lisamiento con un mililitro de PBS-T y pipeta en los tubos luminómetro correspondientes.
Vórtice los tubos del luminómetro y medir la bioluminiscencia de los homogeneiza en un luminómetro. A continuación, prepare diluciones en serie de 10 veces de los 100 microlitros reservados de homogeneizar en placas de cultivo de 24 pocillos utilizando PBS-T. Pipetear 10 microlitros de la dilución en cada placa de agar Middlebrook 7H11 y utilizar un esparcidor de placa estéril para esparcir.
Incubar a 37 grados centígrados durante dos semanas. Después de eso, cuenta las unidades formadoras de colonias. Determinar la relación entre RLU y CFU de BCG lux después de la infección in vivo.
En este experimento, BCG lux virulencia dependiente de la dosis se observó en larvas de G.mellonella durante un período de incubación de 96 horas. Se determinó que la dosis letal necesaria para el 50% de la mortalidad larval era de una 10 veces a la potencia de siete UFC. Los grupos de control inyectados con una dosis de 10 microlitros de PBS-T o aquellos simplemente pinchados simulando lesiones con aguja no afectaron la salud larvaria ni condivan a un aumento de la mortalidad.
Para las larvas infectadas con las dos veces 10 a la potencia de siete dosis de CFU de BCG lux, se observó melanización de la línea dorsal larval a partir de 48 horas después de la infección y se observó melanización sistémica a partir de 96 horas después de la infección. La infección con una 10 veces a la potencia de siete dosis de CFU de BCG lux dio lugar a una disminución inicial de la bioluminiscencia dentro de las primeras 72 horas después de la infección. Sin embargo, después de 72 horas después de la infección, la bioluminiscencia de BCG lux comenzó a meseta, lo que indica el establecimiento de una infección persistente.
En este sistema de infección en particular, la relación in vivo de RLU y CFU osciló entre 2:1 y 5:1 con un promedio de 4:1 sobre el curso de tiempo de 168 horas. Durante la inyección, recuerde asegurar las larvas para minimizar el riesgo de sobrepenetración. La punción accidental del intestino podría conducir a un aumento de la mortalidad.
Mediante la realización de análisis histopatológicos, se puede visualizar la introducción de micobacterias con las células huésped. Un análisis transcriptómico adicional podría revelar la interacción a nivel genómico. El uso de este modelo de infección puede permitir la prueba rápida de nuevos candidatos a medicamentos en una etapa temprana del desarrollo, reduciendo significativamente el número de animales utilizados en la detección de drogas.
Este modelo de infección requiere el uso de una jeringa, que puede estar asociada con una lesión por pinchazo de aguja. Recomendamos el uso de nuestra técnica de inyección para minimizar dicho riesgo.
